4種生物農(nóng)藥對劉氏短須螨的毒力及苦參堿對相關(guān)酶活性的影響

蘇鵬，樊斌琦，王焱，張?jiān)婪?，郝德?/p>

(1．南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037;2．松江區(qū)林業(yè)站，上海 201613;3．上海市林業(yè)總站，上海 201613)

劉氏短須螨Brevipalpus lewisi McGregor屬真螨目Acariformes細(xì)須螨科Tenuipalpidae短須螨屬Brevipalpus，在我國危害葡萄Vitis vinifera、連翹Forsythia suspensa、忍冬Lonicera japonica、紫丁香Syringa oblata、爬山虎Parthenocissus tricuspidata等多種經(jīng)濟(jì)植物和觀賞植物［1］，在美洲、澳洲等地則是柑橘Citrus reticulata的重要害螨［2-3］。自2007年首次在上海發(fā)現(xiàn)劉氏短須螨危害水杉Metasequoia glyptostroboides以來，陸續(xù)在江蘇、安徽、浙江、湖北等省發(fā)現(xiàn)該螨危害水杉。水杉樹形優(yōu)美，樹干通直高大，生長迅速，為亞熱帶平原地區(qū)優(yōu)良的綠化、行道樹種［4-5］。水杉受劉氏短須螨危害后，葉片明顯呈現(xiàn)黃褐色，遠(yuǎn)看如同火燒狀，正常生長和園林綠化效果受到影響。由于水杉多用于行道樹和庭院綠化，因此防治時(shí)應(yīng)選用高效、低毒、低殘留的藥劑。雖然曾進(jìn)行過防治劉氏短須螨化學(xué)藥劑的藥效試驗(yàn)，但是多數(shù)藥劑仍為傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥［6］。本研究選擇4種生物藥劑開展室內(nèi)毒力測定，并測定了苦參堿對劉氏短須螨相關(guān)代謝酶活性的影響，以期篩選出適宜的藥劑及最佳濃度，為生產(chǎn)上有效控制劉氏短須螨危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料供試的劉氏短須螨采自南京林業(yè)大學(xué)校園水杉行道樹。帶回實(shí)驗(yàn)室后，在溫度(25±1)℃、相對濕度65%±10%、光周期14L∶10D條件下，用采自校園內(nèi)健康的水杉葉片飼養(yǎng)，取羽化的第2代成螨用于試驗(yàn)。供試藥劑為0．3%苦參堿水劑(陜西國豐化工有限公司)、0．5%印楝素懸浮劑(山東惠民中農(nóng)作物保護(hù)有限責(zé)任公司)、8000 IU/mg蘇云金桿菌(Bt)懸浮劑(衡陽萊德生物藥業(yè)有限公司)和1．8%阿維菌素乳油(河北益海安格諾農(nóng)化有限公司)。過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酯酶(AchE)的酶活測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毒力測定 將供試藥劑分別稀釋成400，600，800，1000倍液4個(gè)濃度梯度，采用玻片浸漬法測定。把雙面膠帶剪成l cm×2 cm大小，貼在載玻片的1端，選擇健康的劉氏短須螨成螨，用零號毛筆輕輕挑起并將其背部粘在膠帶上，保持足、口器及須肢可自由活動(dòng)，每張玻片30頭螨，排成5排，每排6頭。將粘有成螨的載玻片放在直徑15 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)(皿內(nèi)放1塊濕潤的脫脂棉)，置于25℃下，4 h后在雙目解剖鏡下檢查，挑除死亡個(gè)體并補(bǔ)足活成螨30頭。然后把粘有成螨的玻片置于藥液內(nèi)浸漬5 s后取出，用濾紙吸除載玻片和螨體周圍的多余藥液，移入培養(yǎng)皿內(nèi)，以蒸餾水為對照。于溫度(25±1)℃、相對濕度65%±10%、光周期14L:10D條件下培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。24 h后在顯微鏡下檢查死亡情況。用解剖針輕觸螨體，完全不動(dòng)者視為死亡。分別記錄不同處理的死亡螨數(shù)，計(jì)算死亡率。以Abbott公式計(jì)算校正死亡率，根據(jù)概率值分析法求出毒力回歸方程式、相關(guān)系數(shù)(r)及致死中濃度(LC50)［7-8］。

1.2.2 酶活性測定 1)酶液制備。選擇0．3%苦參堿水劑為供試藥劑，按照致死中濃度LC50配制濃度為7．18 mg/L的藥液備用。將采自校園內(nèi)的健康水杉葉片和葡萄葉片洗凈、晾干。用小型噴霧器噴施配制好的苦參堿藥液2 mL于水杉葉片，之后用零號毛筆將供試成螨接于葉片上;以蒸餾水處理為對照。根據(jù)劉氏短須螨危害葡萄的特性［1］，挑選先期取食水杉葉片的劉氏短須螨健康成螨，接于噴施2 mL蒸餾水的葡萄葉片上飼喂。各處理在24 h后挑取存活個(gè)體進(jìn)行酶活測定，每次取樣100頭，每個(gè)處理重復(fù)3次。根據(jù)各測定目標(biāo)酶的試劑盒說明書，加入不同劑量的生理鹽水，制備成10%的組織勻漿，10 000 r/min于4℃下離心15 min，取上清液進(jìn)行測定。2)酶活性測定方法。過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶活性的測定方法均采用各個(gè)酶活性測定試劑盒提供的說明書中的方法。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 16統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，按劑量對數(shù)和死亡率機(jī)率值的直線回歸法，求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、致死中濃度(LC50)及其95%置信限。過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶間的差異顯著性采用Duncan多重比較法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)毒力測定

2.1.1 室內(nèi)殺螨效果 見表1。

表1 4種藥劑不同濃度毒殺劉氏短須螨的效果

印楝素、阿維菌素、苦參堿和Bt各濃度梯度對劉氏短須螨均表現(xiàn)出殺螨效果，校正死亡率隨著處理濃度的升高而增加。印楝素的防治效果最佳，400倍液的校正死亡率為100%，1000倍液的校正死亡率為52．39%;其次為阿維菌素，400倍液的校正死亡率為97．61%，1000倍液的校正死亡率為40．46%;苦參堿和Bt的防治效果較差，400倍液的校正死亡率分別為52．39%和42．86%，1000倍液的校正死亡率分別僅為2．39%和4．76%。

2.1.2 毒力分析 印楝素對劉氏短須螨的毒力水平最高，致死中濃度LC50為5．36 mg/L;其次為苦參堿，LC50為7．18 mg/L;阿維菌素和Bt相對較低，LC50分別為20．18 mg/L和20．69 mg/L(表2)。

表2 4種藥劑對劉氏短須螨的毒力曲線及LC50

2.2 苦參堿對劉氏短須螨相關(guān)酶活性的影響

7．18 mg/L苦參堿處理24 h后，該螨體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活力達(dá)到2．11 U/mgprot，較對照增加32倍，差異顯著(P＜0．05)。過氧化物酶活力為76．00 U/mgprot，較對照增加16倍，差異顯著(P＜0．05)。而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活力為0．02 U/mgprot，與對照相比差異不顯著(P＞0．05)。蒸餾水處理的劉氏短須螨轉(zhuǎn)移至葡萄葉上飼喂24 h后，3種解毒酶活性均有增強(qiáng)，但是差異未達(dá)顯著水平(P＞0．05)(表3)。

表3 苦參堿處理24 h對劉氏短須螨相關(guān)酶活性的影響

3 討論

已有研究顯示，阿維丙溴磷對劉氏短須螨的毒力最高，噠螨靈次之，甲維鹽防治效果最差［6］。本試驗(yàn)選用了4種生物農(nóng)藥對劉氏短須螨進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，印楝素對劉氏短須螨的毒力最高，致死中濃度達(dá)到5．36 mg/L，苦參堿、阿維菌素和Bt致死中濃度分別為7．18 mg/L，20．18 mg/L和20．69 mg/L，說明4種藥劑對劉氏短須螨都有一定的防治效果，印楝素致死中濃度最低且具有非常明顯的殺螨效果，可以作為首選的生物防治藥劑在生產(chǎn)中應(yīng)用;苦參堿致死中濃度也較低，且苦參堿為廣泛使用的植物源藥劑，效果較好。本研究僅以幾種生物農(nóng)藥對劉氏短須螨進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定，尚需對用藥時(shí)間、最佳用藥濃度以及適宜的施藥器械開展進(jìn)一步的研究。

利用致死中濃度的苦參堿處理24 h后，劉氏短須螨的相關(guān)代謝酶活性發(fā)生了一定變化。其中過氧化物酶和乙酰膽堿酯酶活性顯著增加，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性變化不明顯。過氧化物酶廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，具有較高清除H2O2能力，己在大多數(shù)昆蟲中發(fā)現(xiàn)。乙酰膽堿酯酶是存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的水解酶，該酶活性被抑制，將導(dǎo)致昆蟲的迅速死亡，其敏感性的變化，將直接影響蟲體中毒的程度。本研究中過氧化物酶活性升高說明其在清除過多自由基上具有十分重要的作用，保持螨體內(nèi)細(xì)胞的穩(wěn)定，維持了螨正常的生長發(fā)育。乙酰膽堿酯酶活性的增加體現(xiàn)了其在分解外源毒物，維持正常神經(jīng)生理代謝方面的作用。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是1類催化還原型谷胱甘肽與各種親電化合物親核加成反應(yīng)的酶，在自然界普遍存在，在脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物解毒代謝中發(fā)揮重要作用，是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶之一。參與包括對殺蟲劑在內(nèi)的許多異型生物質(zhì)的解毒［9］。因苦參堿對劉氏短須螨有毒殺作用，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性應(yīng)該被激活，引起劉氏短須螨對苦參堿的解毒，以維持正常的生理功能。但研究中發(fā)現(xiàn)處理組與對照組該酶的活力變化不顯著，可能與處理時(shí)間較短有關(guān)。

對保護(hù)酶、水解酶和解毒酶活力的測定有助于使用藥劑時(shí)選擇最低的適合濃度、最佳劑量以及所需處理的時(shí)間，既要達(dá)到干擾害蟲代謝，阻礙害蟲生長發(fā)育或致死效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)有效合理防治目的，又要避免產(chǎn)生抗藥性，或增加化學(xué)藥劑使用量造成環(huán)境污染，為尋找合理的生物防治新思路提供科學(xué)參考。

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