獲得性骨髓衰竭克隆性造血病理機制

范斯斌 綜述 施均 審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院貧血診療中心，天津300020

獲得性骨髓衰竭克隆性造血病理機制

范斯斌 綜述 施均#審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院貧血診療中心，天津300020

獲得性骨髓衰竭（acquired bonemarrow failure，aBMF）是一組以造血功能不良為主要特征的疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，常見于骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、再生障礙性貧血（aplastic anem ia，AA）和陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）。aBMF患者病理性造血微環(huán)境“龕”（Nich）中的克隆性造血機制復(fù)雜，深入研究其機制對治療aBMF有著重要的意義。

獲得性骨髓衰竭；克隆性造血；骨髓增生異常綜合征；再生障礙性貧血；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥

aBMF是后天因素引起的造血微環(huán)境Nich中的造血干/祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPC）增殖、分化、成熟紊亂的一類疾病，可導(dǎo)致HSPC池功能和（或）數(shù)量的異常，繼而引發(fā)一系或多系血細胞減少，臨床常見于MDS、AA和PNH。HSPC與Nich的良性互動調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是保證正常造血分化的基礎(chǔ)，而克隆性造血與病理性Nich是aBMF病理機制的兩大核心環(huán)節(jié)。有研究表明：克隆性HSPC可誘導(dǎo)病理性Nich，而后者可為HSPC克隆性轉(zhuǎn)化、增殖提供庇護所。

1 骨髓增生異常綜合征

MDS是一組起源于HSPC的惡性克隆性疾病。Woll等[1]研究證實，低危/中危MDS患者骨髓腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）的免疫學(xué)標志為Lin－、CD34＋、CD38－、CD90＋、CD45RA－，人MDS-CSC能夠在小鼠體內(nèi)重建MDS表型，產(chǎn)生人MDS克隆性定向粒-單核系祖細胞、定向巨核細胞-紅系祖細胞；MDS疾病惡性轉(zhuǎn)化中獲得的二次/多次分子突變克隆均攜帶有MDS-CSC原有的del（5q）標志。此外，骨髓造血微環(huán)境紊亂、伴或不伴有基因突變的表觀遺傳學(xué)異常（如DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA剪接異常及M icroRNA調(diào)控異常）也是MDS發(fā)生發(fā)展的主要病理生理機制。

1.1 造血微環(huán)境紊亂

Medyouf等[2]研究發(fā)現(xiàn)：MDS患者來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）與MDS自身HSPC共移植給小鼠后，能夠支持MDS-HSPC重建MDS表型；而且，MDS-HSPC體外作用正常的MSC能夠發(fā)生與病理性MDS-MSC相似的基因組轉(zhuǎn)錄譜和病理性表型。這些數(shù)據(jù)有力地證明：MDS造血微環(huán)境Nich中的MSC能夠提供MDS造血克隆增殖所需要的病理環(huán)境，在疾病的進展與惡化過程中發(fā)揮了重要作用，其中造血微環(huán)境Nich中的CDH2、IGFBP2、VEGFA及LIF等細胞因子有誘導(dǎo)MDS克隆性造血的作用[2-3]。與正常MSC相比，MDS-MSC細胞的體積更大，外觀呈平坦顆粒狀[4-5]。蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果顯示，MDSMSC自身分泌的衰老相關(guān)蛋白P53及P21水平較高，可加速HSPC的衰老進程[4]。此外，細胞周期相關(guān)基因DKN2B在MDS-MSC中呈高表達（8～11倍于正常MSC）[5]，可進一步干擾MSC的生長動力，并造成MSC對正常HSPC的造血支持功能銳減[4]。據(jù)此推測：MDS-MSC形態(tài)學(xué)及增殖能力異常，在一定程度上誘導(dǎo)HSPC細胞周期紊亂，使造血支持功能降低[4-7]。另外，MDS-MSC可下調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶（如CDKN1、CDKN2、CDKN2B、PSRG1）表達，活化非經(jīng)典Wnt信號通路，導(dǎo)致MDS-MSC增殖分化能力受損、衰老加速，進一步損傷自身對HSPC的支持功能[7]。研究還發(fā)現(xiàn)，MDS-MSC抑制絲氨酸蛋白酶抑制劑Kunitz2型（SPINT2）的表達，間接促進了肝細胞生長因子表達，導(dǎo)致MSC自分泌SDF-1因子的增加，改變α-整聯(lián)蛋白基因表達譜，促進多潛能病態(tài)造血細胞與造血微環(huán)境Nich之間的黏附，協(xié)助惡性克隆性HSPC的自我更新、增殖、歸巢，最終誘導(dǎo)MDS表型[8]。TP53基因缺失合并Egr1及Apc基因單倍體缺失，導(dǎo)致基因喪失穩(wěn)定性，造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，可誘發(fā)伴有del（5q）的治療相關(guān)髓系惡性腫瘤[9]。

因此，以病理性MSC為特征的MDS骨髓造血微環(huán)境Nich異常在MDS表型發(fā)生、疾病發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，可干擾正常HSPC增殖、分化、凋亡及正常造血功能，誘導(dǎo)MDS的初始表型，誘發(fā)HSPC病態(tài)細胞惡性增殖；反之，病理性HSPC的克隆性增殖優(yōu)勢可進一步促進MDS向急性白血病轉(zhuǎn)化。

1.2 基因組及表觀遺傳學(xué)異常

1.2.1 DNA甲基化 基因組及表觀遺傳學(xué)改變是MDS發(fā)生發(fā)展的另一個重要的病理環(huán)節(jié)。正常造血調(diào)控基因表達需要富含CpG島的基因啟動子以去甲基化的形式存在；全基因組或特定區(qū)域DNA甲基化異常（獲得或缺失）可直接影響并獨立調(diào)控基因的表觀遺傳學(xué)特性[10]。DNA甲基化異常及CpG島廣泛羥甲基化可沉默細胞周期調(diào)控相關(guān)基因，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因FADD、DAPP1和細胞凋亡相關(guān)基因CYFIP2、FADD[11]，從而干擾細胞周期穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)MDS，并導(dǎo)致疾病進展[10]。研究發(fā)現(xiàn)，重要調(diào)控基因CpG島甲基化可加速MDS向急性髓系白血?。╝cutemyeloid leukem ia，AML）的轉(zhuǎn)化，降低患者總生存率及白血病前期生存率[11-12]。

TET2和DNMT3A是DNA甲基化修飾過程中兩種重要的調(diào)控基因，兩者在MDS患者中的突變率較高，19%～26%的MDS患者存在TET2基因失活性突變[13]。多因素分析表明，MDS患者接受異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT），具有TET2、DNMT3A基因突變陽性患者復(fù)發(fā)率和死亡風(fēng)險高的特點；隨訪觀察表明，TP53、TET2或DNMT3A基因突變均可獨立縮短移植后患者的總生存時間，且死亡患者中攜帶有上述基因突變者占64%。最重要的是，TP53、TET2基因突變皆為預(yù)后不良的獨立危險因素[14]。然而另有研究報道，TET2基因突變與患者的總生存時間無關(guān)，并將DNMT3A基因突變列為預(yù)后不良因素[15-16]。那么，TET2及DNMT3A基因突變究竟是如何干擾DNA甲基化并促進MDS患者克隆性進展的，目前并無定論，尚需進一步研究探索。

有研究報道，與MDS患者相比，MDS繼發(fā)AML患者的IDH1基因突變率更高（3.6%vs 7.5%）[17]，這提示IDH基因突變可作為預(yù)測MDS患者克隆性進展為AML的分子標志[17-18]。然而，Chotirat等[19]對22例MDS患者進行IDH基因測序時發(fā)現(xiàn)，IDH1G10G及IDH2 R140Q的等位基因突變率低（分別為9.09%和4.54%），推測IDH基因突變并非MDS克隆性進展為AML的核心環(huán)節(jié)。但考慮到上述研究的病例樣本量?。╪=22），尚不足以否定IDH基因突變對MDS克隆性進展的驅(qū)動作用。

1.2.2 組蛋白修飾異常 乙?；⒘u甲基化、泛素化等組蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要組成部分。作為多梳抑制復(fù)合物2的催化成分，EZH2基因可調(diào)節(jié)HSPC分化并通過催化H3K27me3的修飾來抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄[20]。約10%的MDS患者存在EZH2基因失活性突變。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)：EZH2基因缺失可誘導(dǎo)HSPC發(fā)生RUNX1S291fs突變；在此基礎(chǔ)上，正常HSPC惡變?yōu)镸DS相關(guān)病態(tài)克隆性HSPC。由此看出，EZH2基因與RUNX1基因呈階梯式誘導(dǎo)MDS的發(fā)生[20]。特別要指出的是，EZH2基因突變在MDS發(fā)生中具有始動作用。深入研究發(fā)現(xiàn)：Hoxa9基因在高危組MDS及AML患者中的表達譜相似；但在EZH2基因缺失條件下，RUNX1S291fs突變可增強多梳抑制復(fù)合物1對Hoxa9基因轉(zhuǎn)錄的抑制，阻礙MDS向AML克隆性進展，但具體機制尚不清楚[20]。由此得知：EZH2基因突變有利于誘導(dǎo)MDS的發(fā)生，但對AML的發(fā)生無促進作用。EZH2基因缺失還在一定程度上干擾DNA啟動子的甲基化水平[20]。由此可推測，組蛋白修飾及DNA甲基化在誘發(fā)MDS過程中存在一定的交叉協(xié)同效應(yīng)。

除EZH2基因外，多梳抑制復(fù)合物家族成員ASXL1基因發(fā)生突變亦很常見。在環(huán)形鐵粒幼細胞性貧血患者中，ASXL1基因突變率僅為6%（5/ 79），但在中高危組MDS（RAEB1型和RAEB2型）及MDS繼發(fā)AML患者中，其突變率可分別高達31%（17/55）及25%（17/67）[21]，提示ASXL1基因突變可預(yù)測MDS患者的克隆性進展，為預(yù)測預(yù)后的獨立不良指標。

1.2.3 RNA剪接體突變 RNA剪接體在mRNA成熟、翻譯過程中具有不可替代的作用。45%～85%的低危組MDS患者剪接路徑突變頻繁[22-23]，其中約 24%為剪接因子（splice factor，SF）的SF3B1基因突變[22]。難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細胞患者的SF3B1基因突變率高達70%～85%[24]，SF3B1突變可上調(diào)染色體8p21.2上的SLC25137基因的表達，導(dǎo)致線粒體鐵過載，促進環(huán)形鐵粒幼細胞形成[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，SF3B1基因單倍體缺乏可導(dǎo)致MDS患者正常骨髓HSPC增殖能力降低、凋亡加速、造血重建能力衰退，但分化能力不受影響，且上述紊亂尚不足以誘發(fā)環(huán)形鐵粒幼細胞形成[24，26]。更重要的是，在疾病進展過程中，SF3B1基因突變并無顯著變化，這提示SF3B1并非MDS惡性克隆性演變的關(guān)鍵[27]。但伴有SF（包括SF3B1、U2AF35、SRSF2）突變的MDS-RAEB及繼發(fā)AML患者的免疫表型高度相似，提示MDSRAEB及AML在本質(zhì)上無嚴格區(qū)別，即伴有SF突變的MDS-RAEB患者預(yù)后不良[28]。因此，SF3B1基因突變與MDS克隆性進展間是否存在必然聯(lián)系有待進一步證實。

U2AF1基因突變多見于年輕的MDS患者，突變率約為7.5%（36/478），低危組MDS患者的U2AF1基因突變相對穩(wěn)定，但突變陽性的MDS患者克隆性進展為AML的時間及總生存時間顯著縮短[29]，說明伴有U2AF1基因突變者的預(yù)后不良。

與U2AF1相反，SRSF2基因突變則更多見于老年患者。SRSF2突變在疾病過程中亦相對穩(wěn)定，同時患者的總生存時間明顯縮短，且預(yù)后不良[30]，推測SRSF2基因突變可能在MDS始動環(huán)節(jié)中作用更為顯著。通常，ZRSR2基因協(xié)同U2AF1、SRSF2基因共同調(diào)節(jié)mRNA剪接，但目前尚無研究證實ZRSR2基因突變可獨自引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[23]。

1.2.4 MicroRNA M icroRNA（m iRNA，m iR）是一種非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與Argonaute蛋白家族相互作用形成復(fù)合物，抑制mRNA/RNA翻譯或影響其穩(wěn)定性，間接調(diào)控靶基因的表達。有研究報道，m iR22過表達可顯著下調(diào)TET2基因[31]，增強大鼠異常HSPC的增殖，損傷髓系造血分化，誘發(fā)AML的產(chǎn)生[32]。MDS患者的m iR125a及m iR99b高表達，兩者可協(xié)同下調(diào)NF-κB信號通路抑制因子，間接促進NF-κB信號通路活化，但后者對MDS克隆性造血的具體調(diào)控機制尚不清楚。同時，m iR125a過表達可干擾骨髓紅系的正常分化發(fā)育[33]，加速MDS克隆性進展。此外，高水平m iR21顯著降低MDS患者對去甲基化藥物的反應(yīng)，縮短其無進展生存時間[34]。因此，某些m iRNA在MDS患者中的過表達可能導(dǎo)致正常HSPC增殖及分化缺陷，加速正常HSPC的凋亡，加速MDS的惡性克隆性演化。

1.2.5 其他基因突變 癌基因Ras可明顯上調(diào)S192依賴的GATA-2基因磷酸化，間接導(dǎo)致染色體上的基因缺失[35]。通過誘導(dǎo)其他基因（EZH2、HECW2、GATA-1）的突變，GATA-2單倍體缺乏的MDS患者發(fā)生AML的危險性顯著增大[36]，這進一步證實GATA-2基因異常對MDS克隆性進展有驅(qū)動作用。Aruna等報道，成骨細胞β-聯(lián)蛋白信號活化突變可上調(diào)成骨細胞Notch信號配體Jagged-1的表達，進而激活正常HSPC中的Notch信號路徑，損傷正常HSPC的分化能力，誘導(dǎo)AML的產(chǎn)生，再次證實骨髓造血微環(huán)境異常是疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[37]。

2 再生障礙性貧血

克隆性轉(zhuǎn)化，如染色體核型異常、轉(zhuǎn)歸為MDS、PNH克隆擴增，是AA患者免疫抑制治療后較為常見的并發(fā)癥。有報道發(fā)現(xiàn)，AA患者MDS克隆相關(guān)的基因突變率極低（5.3%）[38]。但有大樣本（n=150）研究發(fā)現(xiàn)，19%的AA患者在疾病進展過程中可檢測到MDS克隆相關(guān)的基因突變（ASXL1、DNMT3A、BCOR），其中11%的患者克隆性進展為MDS[39]。伴有ASXL1突變者克隆性進展為MDS的可能性更大[39-40]；病程超過6個月的患者往往伴隨端粒長度的縮短，MDS克隆演變率甚至高達40%[39]。有研究還提示：在AA克隆性演變?yōu)镸DS/AML的過程中，端粒長度縮短常先于染色體異常[41]。此外，T淋巴細胞STAT3基因突變的AA患者，骨髓增生相對更差，更易合并7號染色體異常，但其免疫抑制的療效更好，不排除克隆性T細胞對AA患者克隆性進展的抑制效應(yīng)[42]。Babushok等[43]持與傳統(tǒng)不同的觀點，認為多數(shù)AA患者早期即有克隆性造血，其病理機制主要包括兩方面：即，HLA等位基因寡克隆缺失引起的相關(guān)免疫逃逸和體細胞基因突變引起的相關(guān)克隆性造血，進一步證實了免疫機制對AA患者克隆性造血的允許作用。

3 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥

由于HSPC具有獲得性PigA基因突變，PNH患者具有類似MDS的克隆性造血。研究發(fā)現(xiàn)：PigA基因突變不僅可作為始動因子誘發(fā)其他體細胞的基因突變或PigA亞克隆的生成；而且無論正常HSPC還是病理性HSPC，NTNG1、MAGEC1基因克隆性突變均可獨立出現(xiàn)甚至先于PigA基因突變，證實PigA基因可作為其他突變基因的亞克隆而存在[44]。與傳統(tǒng)的PigA基因突變導(dǎo)致PNH克隆性造血的理論不同，該研究證實：PigA基因既可作為原發(fā)突變誘發(fā)其他體細胞突變又可繼發(fā)于后者，單獨或協(xié)同其他基因損傷骨髓中健康HSPC的造血功能；而病理性HSPC獲得克隆性生長優(yōu)勢，產(chǎn)生類似MDS樣克隆性造血異常，但發(fā)生惡性克隆性轉(zhuǎn)化的情況較為罕見。

4 小結(jié)

綜上所述，維持骨髓正常造血功能依賴于造血微環(huán)境（“土壤”）、造血干/祖細胞（“種子”）及免疫監(jiān)視（“蟲子”）的協(xié)調(diào)穩(wěn)定。多種原因誘發(fā)三種因素的異常是骨髓克隆性造血的主要病理、生理機制。深入研究aBMF克隆性造血的病理機制對于研發(fā)干預(yù)性藥物抑制病態(tài)克隆性造血，促進正常HSPC的增殖、分化、發(fā)育，恢復(fù)正常造血多克隆優(yōu)勢均具有重要的理論價值。

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R733.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.04

#通信作者（corresponding author），e-mail：shijun1973@hotmail.com

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