山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達研究

劉 霜，盧建遠，馬 力，夏 威，胡 亮，羅 斌，楊珂?zhèn)?，字向東

(西南民族大學國家民委動物科學重點實驗室，四川 成都 610041)

山羊ZP3基因的cDNA克隆、序列分析及組織表達研究

劉 霜，盧建遠，馬 力，夏 威，胡 亮，羅 斌，楊珂?zhèn)ィ窒驏|

(西南民族大學國家民委動物科學重點實驗室，四川 成都 610041)

對高繁金堂黑山羊和低繁藏山羊ZP3基因cDNA進行克隆、序列分析，并采用Real-time PCR技術對其在發(fā)情前期母羊卵巢組織的表達進行研究.結果表明:山羊ZP3基因編碼區(qū)全長為1269bp，共編碼422個氨基酸，兩品種間有2處堿基差異，但未導致氨基酸的差異.山羊的ZP3基因在卵巢表達量高，與其他組織差異極顯著(P＜0.01)，但兩個品種間差異不顯著(P＞0.05).說明ZP3基因主要在卵巢中表達，但可能不是影響山羊多羔性狀的主基因.

山羊；ZP3；克?。恍蛄蟹治?；qPCR

透明帶(zona pellucida，ZP)是卵母細胞周圍一層糖蛋白基質，該家族有ZP1、ZP2、ZP3和ZP4四種糖蛋白[1-2]，在哺乳動物精卵識別、結合、穿透、胚胎著床等過程中有著關鍵的作用[3-5].人、鼠、雞等中已證實，ZP3蛋白是精子第一受體[6-8]，精卵結合與ZP3糖蛋白的O-糖基化位點息息相關[9].重組人的ZP3同樣能誘導頂體反應，使人的精子和倉鼠透明帶融合[10-11].同時，研究表明敲除ZP3基因的小鼠不能形成透明帶[12].可見ZP3基因對卵透明帶在精卵結合過程具有極為重要的作用.

目前，國內(nèi)外有關山羊多胎機制的研究主要集中在綿羊上，已證實與卵泡發(fā)育和排卵數(shù)的突變基因，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15(BMP15)和及其受體-1B (BMPR1B)等，但結果表明這些基因不是控制山羊多胎的主基因[13-14].對與受精過程密切相關的山羊ZP3基因的研究則未見報導.金堂黑山羊是優(yōu)良的多胎(平均產(chǎn)羔率240%)肉山羊品種[15]，而藏山羊則是單胎肉山羊品種[16].因此，本研究以多胎金堂黑山羊和單胎藏山羊為研究對象，首次對不同產(chǎn)羔率的山羊品種的ZP3基因進行cDNA克隆、序列分析和組織表達研究，以期從受精環(huán)節(jié)探討山羊多胎性狀的分子調(diào)控機制奠定一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選用5只健康成年雌性四川金堂黑山羊和5只四川理縣藏山羊，在同期發(fā)情取出陰道栓塞(CIDR)后40h，屠宰羊只，即刻采集卵巢、輸卵管、子宮、垂體等組織，液氮凍存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑

反轉錄試劑盒購自FERMENTAS(MBI)公司；2 ×Taq PCR Master Mix、感受態(tài)細胞均購自購自康迪生物技術有限公司；氨芐青霉素(Ampr)、克隆載體pMD-19 Vector購自大連寶生物公司；Sso Advanced TMSYBR?Green Super mix，購自伯樂公司.

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol法提取金堂黑山羊和藏山羊卵巢、輸卵管、子宮、垂體組織中的總RNA，按Fermentas (MBI)反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，保存?zhèn)溆?

1.4 引物設計及目的基因PCR擴增

根據(jù)NCBI上已收錄的牛ZP3基因mRNA序列(NM173974)，設計克隆引物和qPCR引物(表1). PCR擴增程序:95.0℃預變性5 min；94.0℃變性40s，60.0℃、退火40s；72.0℃延伸1 min，32個循環(huán)；最后72.0℃延伸5 min；4.0℃保存.

表1 ZP3克隆及定量引物序列Table 1 Primer pairs of ZP3 for cloning and qPCR

1.5 目的基因的克隆、鑒定及測序

PCR產(chǎn)物電泳檢測，連接，轉化.取菌液PCR鑒定，挑選陽性克隆菌液2mL送上海英俊生物技術有限公司測序.

1.6 山羊ZP3基因的生物信息學分析

利用DNAman軟件對獲得的上下游序列進行拼接.從NCBI上檢索的人(NM_001110354)、牛(NM_ 173974)、牦牛(GQ856646)、豬(NM_213893)、鼠(NM _011776)、雞(NM_204389)的ZP3基因相應的核苷酸序列進行多重對比，構建物種分子進化樹.用NCBI在線程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html)對所得兩種山羊ZP3序列進行ORF查找，將CDS區(qū)翻譯成氨基酸序列.ProtParam程序分析ZP3蛋白的一級結構，理化參數(shù)；ProtScal程序分析山羊ZP3蛋白疏水性；TMHMM2.0 Server程序進行跨膜區(qū)預測；SignalP 4.0 Server程序預測信號肽；NetOGlyc4.0程序分析O-糖基化位點；GOR程序預測蛋白質二級結構；Phyre2程序預測蛋白質三級結構.

1.7 山羊ZP3基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

通過DNAman、DNAstar等生物分析軟件對兩品種ZP3基因序列進行同源性比對，并利用生物軟件MAGA 6.0構建ZP3基因的分子系統(tǒng)進化樹.

1.8 qPCR

qPCR反應體系為10μL:ZP3上下游引物(表1)各0.8μL，SsoAdvancedTM SYBR?Green Super mix 5μL，ddH2O 2.9μL，cDNA模板0.5μL.反應程序: 95.0℃預變性3min，95.0℃/10s、57.6℃/20s，35個循環(huán).每個樣品為3個重復，并且設置不加模板為對照，取平均值進行數(shù)據(jù)分析.

1.9 統(tǒng)計分析

qPCR所得數(shù)據(jù)用Pfaffl法[17]分析ZP3在金堂黑山羊和藏山羊卵巢組織及其他組織的相對表達量，RE＝(1+E ref)Ctre/(1+E target)Cttarget.兩品種ZP3基因表達量用t檢驗法進行顯著性差異分析.

2 結果

2.1 藏山羊和金堂黑山羊ZP3基因PCR擴增結果

以金堂黑山羊和藏山羊總cDNA為模板，擴增ZP3基因，得到約1300bp左右的片段，與預期相符，并以菌液作為模板進行PCR擴增，所得片段大小也與預期相符(圖1).

圖1 ZP3基因PCR產(chǎn)物電泳檢測1.DNA Marker DL2000；2、3.金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因擴增結果Fig.1 Electrophoresis results of ZP3 PCR product1.DNA marker DL2000；2，3.ZP3 of Jintang black goat and Tibetan goat

2.2 金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因CDS序列分析

用DNAman軟件對測序所得ZP3序列拼，得到1269bp同樣長度的片段.金堂黑山羊與藏山羊基因編碼區(qū)的同源性為99.85%，均長1269bp，編碼422個氨基酸.金堂黑山羊和藏山羊兩品種核苷酸序列有兩處不同，第356位C→T，第581位A→G，但是核苷酸的差異沒有引起氨基酸的差異.金堂黑山羊ZP3基因CDS區(qū)的核苷酸序列與藏山羊及NCBI中牛(NM_ 173974)、牦牛(GQ856646)、豬(NM_213893)、鼠(NM _011776)、雞(NM_204389)進行對比，相應序列間的一致性分別為99.8%、96%、95%、86%、71.5%、54.6%.

利用MEGA6.0構建系統(tǒng)進化樹(圖2)，藏山羊和金堂黑山羊先聚為一類，牛與牦牛聚為一類再與山羊聚為一類，然后和豬，鼠聚為一類，最后和雞聚成一大類，這與哺乳動物的進化程度保持一致. 2.3 金堂黑山羊和藏山羊ZP3蛋白的結構特征

圖2 基于核苷酸序列的金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZP3 gene of Jintang black goat and Tibetan goat

Protparam分析結果表明，金堂黑山羊和藏山羊蛋白的分子式為C2074H3260N588O602S23，相對分子質量為46801.6，理論等電點PI為7.19，半衰期為4.4h，不穩(wěn)定參數(shù)為50.01，屬不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)82.84.疏水性分析，顯示大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸，判定ZP3蛋白為親水性蛋白.SignalP3.0信號肽預測，ZP3基因第1-22(Met-Pro)氨基酸序列是信號肽位點，信號肽裂解點位于第22位Pro和第23位Glu之間，屬分泌型蛋白.TMHMM 2.0進行跨膜區(qū)分析，ZP3蛋白只存在一個跨膜區(qū)，位于氨基酸第382-404之間.NetOGlyc4.0分析，ZP3基因存在10個O-糖基化位點.

GOR程序在線預測ZP3蛋白二級結構，結果顯示ZP3蛋白包括α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲，分別占靶蛋白的2.13%、34.36%和63.51%，由此可見無規(guī)卷曲在ZP3蛋白二級結構中有重要作用.PHYRE2.0預測ZP3蛋白的三級結構(圖3)，殘基建模覆蓋率63% (266個氨基酸殘基)，置信度達100%，說明ZP3蛋白與模板蛋白的空間結構比較接近，適合的空間結構比例大. 2.4 組織差異表達分析

圖3 ZP3蛋白三級結構預測Fig.3 Prediction for the tertiary structure of ZP3 protein

對ZP3基因在金堂黑山羊和藏山羊4個組織中的mRNA表達量的分析結果表明:ZP3基因mRNA在山羊卵巢、子宮、輸卵管、垂體中均有表達，但在卵巢表達量最高，與其他組織差異極顯著(P＜0.01，圖4)，而兩品種之間差異不顯著(P＞0.05).

圖4 ZP3基因在金堂黑山羊和藏山羊不同組織中的相對表達量(Mean±SE)Fig.4 Expression of ZP3 gene in different tissues of Jintang black goat and Tibetan goat(Mean±SE)

3 討論

精子與ZP3受體結合后，形成受體配體復合物，從而激發(fā)精子發(fā)生頂體反應和透明帶反應.在精卵識別和粘附過程中，ZP3蛋白的O-連接糖基化位點具有極關鍵作用[18].O-聚糖俗稱粘蛋白，與細胞的識別、粘附及細胞凋亡等生命過程密切相關[19].小鼠定點突變實驗表明，ZP3蛋白的Ser332和Ser334位的絲氨酸的O-糖基化位點是結合精子的必須基團[20].而研究者在生物進化過程中發(fā)現(xiàn)，Ser332和Ser334附近的氨基酸發(fā)生改變，導致種的特異性，從而影響精卵結合[21].本研究對多胎山羊品種(金堂黑山羊)和單胎山羊品種(藏山羊)ZP3基因的克隆、生物信息學分析表明，兩品種ZP3基因cDNA序列一致性達到99.8%，與牛和牦牛的序列一致性達到96%[22]，說明山羊ZP3基因cDNA序列比較保守.山羊的ZP3基因編碼區(qū)序列與其他物種同源性很高，在哺乳動物中較保守，分子系統(tǒng)進化樹構建結果也符合進化系統(tǒng).山羊ZP3蛋白分子量為46.80kD，與普通牛(46.55kD)和牦牛(46.62kD)蛋白分子量差異不大[22].目前，有關卵透明帶的研究主要集中在受精過程時精子的特異性位點識別及相關分子機制[23].本研究發(fā)現(xiàn)兩個山羊品種的氨基酸序列都為10個O-糖基化位點，說明O-糖基化結合位點不會導致金堂黑山羊和藏山羊在受精環(huán)節(jié)的差異.

哺乳動物中，人和鼠的ZP3蛋白主要在卵巢組織中表達，在其他組織只有微量表達[12，24]；魚類中，紅鯽和中華鱘等的ZP3蛋白在卵巢中的表達量極顯著于心臟、肝臟、腦等[25-26].本實驗熒光定量PCR結果顯示，金堂黑山羊和藏山羊ZP3基因在子宮、輸卵管和垂體均有極低表達，但是在卵巢中的表達量顯著高于其它組織(P＜0.01)，說明ZP3基因在卵巢組織具有表達特異性，體現(xiàn)ZP3基因在透明帶中的重要作用.但是兩個品種間差異不顯著(P＞0.05)，說明ZP3基因不是影響山羊產(chǎn)羔性狀的主要原因.

4 結論

本試驗首次克隆了山羊ZP3基因，多胎金堂黑山羊與單胎藏山羊ZP3基因CDS編碼區(qū)存在2處核苷酸差異，但未導致氨基酸的差異.山羊和其他物種的ZP3基因的同源性高，在生物進化上高度保守.山羊ZP3基因包含一個1269bp的開放閱讀框，編碼422個氨基酸.ZP3基因在兩山羊品種間的表達無顯著差異.

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(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

cDNACloning，sequence analysis and tissue expression of goat ZP3 gene

LIU Shuang，LU Jian-yuan，MA Li，XIA Wei，HU Liang，LUO Bin，YANG Ke-wei，ZI Xiang-dong
(The Key Laboratory of Animal Science of State Ethnic Affairs Commission，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

This study was carried out for ZP3 gene cloning and sequence analysis on non-prolific Tibetan goats and prolific Jintang black goats，and its mRNA expression levels in ovary at pro-estrus were determined by real-time PCR.The result showed that the coding region sequence(CDS)of goat ZP3 gene was 1269bp long，encoding 422 amino acids.There were 2 basic differences between the two breeds without amino acid change.The mRNA expression level was higher in ovary than in other tissues (P＜0.01)，but there was no differential expression between the two breeds(P＞0.05).The result shows that ZP3 gene is highly expressed in ovary，but it may not be the major gene to determine the kidding rate in goat.

goat；ZP3；cloning；sequence analysis；qPCR

S814；S827

A

2095-4271(2015)04-0412-05

10.11920/xnmdzk.2015.04.004

2015-04-01

字向東(1963-)，男，白族，云南云龍人，教授，研究方向:動物遺傳育種與繁殖，E-mail:zixd＠sina.com

四川省應用基礎項目(2013JY0043)；西南民族大學研究生創(chuàng)新型科研項目(CX2014SZ69)