不同提取方法對(duì)山藥多糖含量及其體外抗氧化活性的影響*

高行恩，王洪新

1(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院酒店與旅游管理學(xué)院，江蘇淮安，223003)

2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué)國家功能食品工程技術(shù)中心，江蘇無錫，214122)

山藥是薯蕷屬植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.)的塊莖，含有多糖［1］、皂苷［2］、多酚［3］等多種生物活性物質(zhì)。其中，山藥多糖是山藥的主要功能性成分［2］。研究表明，山藥多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)脾胃、修復(fù)腎小管、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性［4-6］。植物多糖的傳統(tǒng)提取方法為水提法。近年來，隨著新興提取技術(shù)的快速發(fā)展，超聲波輔助法［7-8］、酶法［9-12］、微波輔助法［13-14］等在山藥多糖的提取中得到了應(yīng)用。植物多糖組分復(fù)雜，采用不同提取方法可能會(huì)引起得率、組分及生物活性的變化［15-16］。然而，新興提取技術(shù)對(duì)山藥多糖生物活性的影響，罕有報(bào)道。此外，山藥多糖因產(chǎn)地［17］、品種［18］、生長期［19］、測(cè)定方法不同而導(dǎo)致其含量差異較大。本文以江蘇淮安10月份所產(chǎn)淮山藥為研究對(duì)象，考察不同提取方法對(duì)山藥多糖含量及其體外抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淮山藥，江蘇淮安10月份產(chǎn);無水乙醇、無水甲醇、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、苯酚、濃H2SO4、三氯乙酸、H2O2、鄰二氮菲、三羥基甲基氨基甲烷、葡萄糖、H3PO4、K4Fe(CN)6、FeSO4、鄰苯三酚，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)分析純，購自美國Sigma公司;纖維素酶(500U/mg)、果膠酶(100U/mg)、酸性蛋白酶(800U/mg)，均為食品級(jí)，購自江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;WFZ UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司;GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AVM 602/WH微波爐，PHILIPS、SEIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;YQ-9200超聲波清洗機(jī)，上海易凈超聲波儀器有限公司、DL-5-B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

新鮮山藥洗凈，去皮，切片(3 mm厚)，冷凍干燥，粉碎過60目篩，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流脫脂，揮干溶劑，備用。

1.3.2 提取方法

水提法［20-21］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按不同的料液比，恒溫水浴60～180 min，提取2次，合并提取液。超聲法［22］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按一定料液比，在恒溫水浴中超聲提取30～180 min，提取2次，合并提取液。微波法［15］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按一定料液比，微波處理5～35 min，提取2次，合并提取液。酶法［14］:準(zhǔn)確稱取山藥干粉20 g，按照不同加酶量，加入由纖維素酶、果膠酶、蛋白酶(質(zhì)量比1∶1∶1)配成的復(fù)合酶，在最適pH條件下，恒溫酶解30～150 min，90℃將酶滅活，提取2次，合并提取液。

1.3.3 多糖的制備

將提取液真空濃縮至100 mL，離心除去雜質(zhì)，Sevag法除去蛋白［23］，蒸餾水中透析12 h，于透析液中加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置12 h。抽濾，分別用100 mL的無水甲醇和丙酮洗滌殘?jiān)?次，揮發(fā)干溶劑，真空冷凍干燥，可得粗多糖，稱重備用。

1.3.4 山藥多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法［24］，精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，用蒸餾水定容至1 000 mL。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL具塞試管內(nèi)，補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL，另取1支具塞試管加入2.0 mL蒸餾水作為對(duì)照。每只試管精密加入濃度6 mg/mL的苯酚溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)1.0 mL、濃 H2SO45.0 mL，混勻，放置10 min，后搖勻，再次放置20 min，在490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量X為橫坐標(biāo)，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=9.638 6X，R2={0.999 9。}線性范圍:10～200 μg。

稱取10 mg山藥粗多糖溶于水，定容至100 mL。將待測(cè)液每份精密移取1.0 mL，置10 mL具塞試管內(nèi)，加入蒸餾水1.0 mL，按以上操作，測(cè)定吸光度(每份樣品做3個(gè)平行，取平均值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中葡萄糖含量，再乘以系數(shù)0.9換算為多糖含量。山藥多糖得率計(jì)算公式:

1.3.5 正交優(yōu)化多糖提取工藝

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)。水提法以料液比、提取溫度、提取時(shí)

間為考察因素，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)。超聲法以料液比、超聲功率、提取溫度、提取

時(shí)間為考察因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。微波法以料液比、微波功率、提取時(shí)間為考

察因素，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)。酶法以料液比、加酶量、提取溫度、提取時(shí)間為考察

因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

表1 水提法正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal testwith hot water extraction method

表2 超聲法正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test with ultrasonic extraction method

表3 微波法正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal testwith microwave extraction method

表4 酶法正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels table of orthogonal test with enzymatic extraction method

1.3.6 粗多糖中雜質(zhì)的檢測(cè)

通過紫外掃描檢測(cè)260～280 nm波長內(nèi)是否有吸收峰來判斷粗多糖中是否含有蛋白質(zhì)、多肽、核酸等。通過Folin-Ciocalteu(FC)法測(cè)定粗多糖中的總酚含量［25-26］。

1.3.7 體外抗氧化能力測(cè)定

還原力測(cè)定［27］:將2 mL H3PO4緩沖液(pH值為6.6)、2 mL K4Fe(CN)6溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)和1 mL山藥粗多糖溶液(濃度 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)加入具塞比色管中，充分振蕩混勻后50℃水浴20 min，迅速冷卻。加入2.5 mL三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，混勻后3 000 r/min離心20 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水和 FeCl3各2.5 mL，混勻，靜置10 min。在700 nm波長處測(cè)定吸光度。3次平行，取平均值。

DPPH·清除能力測(cè)定［28］:將2 mL山藥粗多糖溶液與2 mL DPPH(0.1 mol/mL，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇)充分混勻后，避光靜置20 min，在517 nm波長處測(cè)吸光度Ai。將2 mL山藥粗多糖溶液與2 mL 95%的乙醇混勻后測(cè)吸光度Aj，將2 mL蒸餾水與2 mL DPPH溶液混勻后測(cè)吸光度Ac。3次平行，取平均值。按下述公式計(jì)算清除率:

·OH清除能力測(cè)定［29］:將1 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、1 mL鄰二氮菲溶液(2.5×10-3mol/L)、1 mL FeSO4溶液(2.5×10-3mol/L)、1 mL山藥多糖水溶液(濃度 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)、0.5 mL 雙氧水(0.02 mol/L)，混勻后，37 ℃ 水浴60 min，在536 nm波長處測(cè)定吸光度Ai。以1 mL蒸餾水取代多糖水溶液，重復(fù)上述操作，吸光度為Aj。以1.5 mL蒸餾水取代多糖水溶液和雙氧水溶液，重復(fù)上述操作，吸光度為Ac。3次平行，取平均值。按下述公式計(jì)算清除率:

O2-· 清除能力測(cè)定［8］:將 6 mL Tris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液和1 mL山藥粗多糖溶液(濃度0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL)加入試管中混勻，37℃ 水浴20 min，再加1 mL鄰苯三酚鹽酸溶液(7 mmol/L，37℃預(yù)熱)，充分混勻后，反應(yīng)4 min，然后加入濃HCl終止反應(yīng)。在325 nm波長處測(cè)定吸光度Ai。以1 mL蒸餾水代替樣品液，重復(fù)上述操作，測(cè)定吸光度Aj。按下述公式計(jì)算清除率:

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析預(yù)處理，采用S-N-K9(S)法對(duì)不同提取方法對(duì)多糖得率的影響進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對(duì)山藥多糖含量的影響

2.1.1 水提法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20(g∶mL)、溫度 80 ℃、提取 150 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。由表5極差分析可知，水提法中影響山藥多糖提取的3個(gè)因素，其主次順序?yàn)?時(shí)間＞溫度＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比 1∶20、提取溫度 80℃、提取時(shí)間 180 min。

表5 水提法提取山藥多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith hot water extraction method

2.1.2 超聲法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20、微波功率400 W、溫度70℃、提取120 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 超聲法提取山藥多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith ultrasonic extraction method

由表6極差分析可知，超聲法中影響山藥多糖提取的4個(gè)因素，其主次順序?yàn)?提取時(shí)間＞超聲功率＞提取溫度＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3D1，即料液比1∶20、超聲功率400 W、提取溫度80℃、提取時(shí)間90 min。

2.1.3 微波法

單因素確定山藥多糖適宜的提取條件為:料液比1∶20、微波功率550 W、提取20 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得正交試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。由表7極差分析可知，微波法中影響山藥多糖提取的3個(gè)因素，其主次順序?yàn)?提取時(shí)間＞微波功率＞料液比。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B2C3，即料液比1∶20、微波功率550 W、提取時(shí)間25 min。

表7 微波法提取山藥多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 7 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith microwave extraction method

2.1.4 酶法

單因素確定山藥多糖的適宜提取條件為，料液比1∶20、加酶量0.45%、溫度50℃、提取60 min。以此為基礎(chǔ)，以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所得正交試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。由表8極差分析可知，酶法中影響山藥多糖提取的4個(gè)因素，其主次順序?yàn)?料液比＞加酶量＞溫度＞提取時(shí)間。結(jié)合不同因素的K值比較，優(yōu)化工藝為A2B3C2D2。然而該最佳工藝并未出現(xiàn)在正交表中，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)工藝得率為9.65%，高于正交表中的最高得率9.43%。因此，可以確定酶法提取山藥多糖的最佳工藝為:料液比1∶20、加酶量0.55%、溫度50℃、提取時(shí)間60 min。

表8 酶法提取山藥多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental design and results of extracting Chinese yam polysaccharideswith enzymatic extraction method

2.1.5 不同提取方法所得山藥多糖含量的比較

4種不同提取方法在上述最優(yōu)條件下，分別提取3次，取平均值。不同提取方法所得山藥多糖含量對(duì)比如表9所示。

表9 不同提取方法對(duì)山藥多糖含量的影響(n=3)Table 9 Effects of extract methods on the yields of Dioscorea opposita polysaccharides(n=3)

由表9可知，酶法、微波法、超聲法均顯著提高了山藥多糖得率(P＜0.05)，縮短了提取時(shí)間。酶法效果最好，多糖得率提高27.48%，耗時(shí)僅為水提法的1/3。這是因?yàn)橹参锛?xì)胞壁的主要成分為纖維素、半纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶促進(jìn)了細(xì)胞壁的破裂，有利于多糖從細(xì)胞中釋放［14］。山藥中有大量多糖以糖蛋白的形式存在［30］，蛋白酶將蛋白水解，有助于多糖的溶出。微波則使原料內(nèi)部的水分等極性物質(zhì)迅速吸收能量而大量產(chǎn)熱，液態(tài)水氣化而產(chǎn)生壓力致使細(xì)胞破裂，形成微小的孔洞，有利于多糖成分的迅速溶出［15-16］。超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用可以加速細(xì)胞壁的破碎，從而加快多糖釋放，節(jié)省提取時(shí)間［9］。與超聲和微波提取法相比，酶法提取條件溫和，避免多糖因?yàn)閯×艺饎?dòng)而導(dǎo)致的降解，有利于多糖結(jié)構(gòu)的保持。與水提法相比，酶法提取使得多糖的釋放和溶解相對(duì)迅速和徹底。此外，在該實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過酶法提取，蛋白質(zhì)被水解，解決了山藥粗多糖中存在大量結(jié)合蛋白的問題，省去了多糖脫蛋白的環(huán)節(jié)，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，減少甚至避免了三氯甲烷的使用，更為安全、環(huán)保。

2.2 山藥多糖中雜質(zhì)成分的含量

多糖在提取中容易混雜蛋白、酚類等雜質(zhì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Sevag法8次除蛋白后，經(jīng)過紫外掃描，在260 nm和280 nm處無吸收峰，說明樣品中不含蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。福林試劑檢測(cè)為陰性，說明無酚類雜質(zhì)。

2.3 不同提取方法對(duì)山藥多糖體外抗氧化活性的影響

2.3.1 不同提取方法對(duì)山藥多糖還原力效果的影響

抗氧化劑通過還原作用提供電子而清除自由基。在此評(píng)價(jià)方法中，還原力越強(qiáng)，其抗氧化效果越好。通過測(cè)定700 nm處還原產(chǎn)物的吸光度，能夠判斷還原能力，進(jìn)而反應(yīng)其抗氧化能力。由圖1可知，不同提取方法所得的山藥多糖都具有一定的還原力，且隨濃度增大而升高，最終達(dá)到最大還原力。酶法和微波法效果較好，在多糖濃度2.0 mg/mL時(shí)，吸光度分別可達(dá)1.8、1.45;水提和超聲法較弱，在多糖濃度2.0 mg/mL時(shí)，吸光度僅為1.0和0.9。

圖1 不同提取方法所得山藥多糖的還原力Fig.1 The reducing power of Dioscorea opposita polysaccharides

2.3.2 不同提取方法對(duì)山藥多糖DPPH·清除能力效果的影響

抗氧化劑提供電子與DPPH自由基的孤對(duì)電子配對(duì)，DPPH由深紫色的自由基形式被還原成黃色的非自由基形式，所接受的電子數(shù)量與其褪色程度成定量關(guān)系，因而可以通過吸光度的變化進(jìn)行定量分析［31-32］。由圖2可知，隨著濃度的增大，不同提取方法所得山藥多糖的清除DPPH自由基能力均呈上升趨勢(shì)且逐漸接近。酶法提取的多糖在濃度為0.5 mg/mL時(shí)自由基清除能力可達(dá)91%。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，微波法清除能力為78%、酶法為68%、水提法為51%。

圖2 不同提取方法所得山藥多糖的DPPH·清除能力Fig.2 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on DPPH radicals

2.3.3 不同提取方法對(duì)山藥多糖·OH清除能力效果的影響

多糖分子末端的半縮醛羥基具有還原性，可將自由基還原，從而阻止自由基連鎖反應(yīng)。由圖3可知，酶法提取的多糖清除羥基自由基能力最強(qiáng)，微波法和水提法相近，超聲法最弱。在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，酶法提取的多糖對(duì)羥基自由基的清除率為98%，微波法為75%，水提法為65%，超聲法為54%。

圖3 不同提取方法所得山藥多糖的·OH清除能力Fig.3 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on hydroxyl radicals

2.3.4 不同提取方法對(duì)山藥多糖O2-·清除能力效果的影響

由圖4可知，O2-·清除能力隨多糖濃度提高而上升以至最大值。不同濃度時(shí)，4種提取方法所得多糖清除O2-·的能力有所不同。多糖濃度0.25mg/mL時(shí)，水提法和超聲法清除O2-·能力接近，清除率分別為31%、27%;微波法和酶法效果相當(dāng)，清除率分別為50%、49%。多糖濃度1.0 mg/mL時(shí)，酶法效果最好，其次為微波法和水提法，最后為超聲法。而多糖濃度高于2.0 mg/mL時(shí)，微波法效果最好;多糖濃度為4.0 mg/mL時(shí)，酶法和水提法效果相當(dāng)。

圖4 不同提取方法所得山藥多糖的O2-·清除能力Fig.4 Scavenging effect of Dioscorea opposita polysaccharides on superoxide radicals

3 結(jié)論

本文以江蘇淮安10月份所產(chǎn)同一批次的淮山藥為實(shí)驗(yàn)原料，采用水提法、超聲法、微波法、酶法4種提取方法制備了山藥多糖，并就其含量和抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定和比較。確定了提取山藥多糖得率最高的方法為酶法，且該方法大大縮短了提取時(shí)間，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)步驟，更為安全、環(huán)保。通過對(duì)體外抗氧化能力的四種評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同提取方法所制得的山藥多糖均具有較好的體外抗氧化活性。就其總還原力、DPPH·清除能力、·OH清除能力而言，酶法制備的多糖抗氧化能力最好，其余依次為微波法、水提法、超聲法。這是因?yàn)?，多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，如分子質(zhì)量、化學(xué)組成、糖苷鍵、分支度、立體構(gòu)象等［33］。酶法提取條件較為溫和，可能較好地保持了多糖分子的結(jié)構(gòu)，有利于其抗氧化活性的保持。而其他方法所制得的多糖抗氧化活性的損失則可能會(huì)破壞多糖分子結(jié)構(gòu)。但其O2-·自由基清除能力，微波法＞酶法＞水提法＞超聲法?？傮w而言，酶法輔助提取所制備的山藥多糖得率高、抗氧化活性強(qiáng)，便于深入研究。然而，不同提取方法對(duì)山藥多糖結(jié)構(gòu)的影響及其與抗氧化活性之間的關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。

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