利用二維電泳技術(shù)檢測(cè)大麥種子純度*

隋麗麗，榮芷銘，董慧明，董亮，祖國(guó)仁，趙長(zhǎng)新

1(大連工業(yè)大學(xué)，生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧沈陽(yáng)，110015)

大麥作為啤酒釀造的主要原料，大麥品種的純度是大麥質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由不同大麥品種制得的麥芽差異性也是導(dǎo)致啤酒酒體差異的因素之一［1］。近些年來(lái)，隨著國(guó)際大麥價(jià)格的持續(xù)走高，市場(chǎng)上不同品種大麥的價(jià)格相差每噸達(dá)數(shù)十美元［2］，這就導(dǎo)致一些商家以次充好或者好壞混合再以好的出售，甚至在大麥的產(chǎn)地就已經(jīng)出現(xiàn)上述情況。我國(guó)每年大麥的進(jìn)口量很大，國(guó)內(nèi)大麥由于質(zhì)量等因素一直很難滿足國(guó)內(nèi)啤酒生產(chǎn)的需要。因此，若不能對(duì)大麥純度進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，將會(huì)對(duì)我國(guó)大麥消費(fèi)及啤酒企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，國(guó)內(nèi)外已建立了多種利用生物化學(xué)與分子生物學(xué)對(duì)大麥品種純度檢測(cè)方法，主要以大麥種子醇溶蛋白的單向電泳法和基于DNA技術(shù)的分子標(biāo)記法為主［3］。利用大麥提取醇溶蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)具有簡(jiǎn)便快捷、費(fèi)用低、穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)［4］，但由于單向電泳條帶比較密集，容易對(duì)檢測(cè)造成一定的困難和誤差。因此，很多企業(yè)逐漸采用DNA分析技術(shù)進(jìn)行SSR標(biāo)記［5-6］，其結(jié)果雖然很準(zhǔn)確，但對(duì)樣品DNA提取技術(shù)及設(shè)備的要求非常嚴(yán)格，檢測(cè)的成本較高，對(duì)于一般企業(yè)的使用存在一定困難。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，利用雙向電泳技術(shù)檢測(cè)大麥種子純度已成為可能。

目前，二維電泳技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心和首選技術(shù)［7-8］，利用二維電泳技術(shù)能夠比較、分析生物樣品在不同條件下蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出特異功能的蛋白質(zhì)及基因。二維電泳技術(shù)利用的是蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量2個(gè)特性，在水平(第一向)和豎直(第二向)方向分別進(jìn)行蛋白質(zhì)的等點(diǎn)聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，進(jìn)而得到蛋白質(zhì)的二維分離圖譜。隨著植物功能基因組學(xué)研究的深入，該技術(shù)已在擬南芥［9-10］，水稻［11-12］等模式植物中得到廣泛應(yīng)用;對(duì)于一些非模式生物，如大豆［13］、煙草［14］、番茄［15］等，也展開(kāi)了相關(guān)研究，并且雙向電泳圖譜可得到更多蛋白質(zhì)點(diǎn)，檢測(cè)準(zhǔn)確快速，且較基因法更經(jīng)濟(jì)，不失為一種大麥純度檢測(cè)的可靠方法。

本論文利用雙向電泳技術(shù)結(jié)合PDQuest軟件，對(duì)人工混種的不同純度大麥種子進(jìn)行蛋白質(zhì)圖譜分析，找出不同大麥品種間的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，并對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行圖譜的3D峰高度比較，建立了純度與差異蛋白質(zhì)點(diǎn)3D圖峰高度間的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大麥種子的純度分析檢測(cè)與方法建立。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大麥純品種:甘啤4號(hào)、單2號(hào)，由百威英博啤酒集團(tuán)哈爾濱有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

多功能電泳儀，北京六一儀器廠;Binta 2020D凝膠成像系統(tǒng)，BINTA;PDQuest8.0分析軟件，Biorad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取

分別取甘啤4號(hào)、單2號(hào)大麥各1 g，去皮后加液氮研磨，采用緩沖液苯酚法提取大麥中的水溶蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后分裝，置于-80℃冰箱中備用［16］。

1.3.2 雙向電泳操作

(1)膠條制作。在翟明昌［17］的方法基礎(chǔ)上略加改進(jìn):取 0.6g 尿素，540 μL 雙蒸水，200 μL 30%丙烯酰胺溶液，pH值4～6載體兩性電解質(zhì)24 μL，pH值3～10載體兩性電解質(zhì)溶液4.8 μL，輕緩混勻后依次加入5 μL 10%過(guò)硫酸銨和4 μL TEMED?；靹蚝罂焖傥?00 μL上述混合液，從玻璃管(直徑1mm，長(zhǎng)10 cm)的一端緩慢均勻灌入，注膠量保證每根膠長(zhǎng)度為7 cm，室溫聚合1 h。

等電聚焦及電泳:陰極電泳緩沖液:20 mmoL/L NaOH 150 mL;陽(yáng)極電泳緩沖液:10 mmoL/L H3PO4200 mL。

(2)電泳條件。接通電源，室溫下200 V恒壓電泳30 min，500 V恒壓電泳30 min，1 350 V恒壓電泳4 h。

等電聚焦結(jié)束后將膠條從玻璃管中緩慢均勻擠出，在含 0.05 moL/L Tris-HCl(pH 8.8)、0.3 g/mL甘油、23 mg/mL SDS、6 mmoL/L尿素的平衡緩沖液中平衡30 min，轉(zhuǎn)移至12%分離凝膠，20 mA恒流電泳。電泳結(jié)束后，將得到的凝膠進(jìn)行“Blue Silver”考馬斯亮藍(lán)染色，雙蒸水脫色［18］。

(3)凝膠圖像分析。通過(guò)Binta 2020D型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，PDQuest8.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種及不同純度大麥雙向電泳分析

對(duì)甘啤4號(hào)、單2號(hào)大麥進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，得到電泳圖譜如圖1所示。

圖1 甘啤4號(hào)和單2號(hào)大麥雙向電泳圖譜Fig.1 Proteome analysis of Ganpi 4 and Dan 2 barley cultivars by two-dimensional electrophoresis

經(jīng)過(guò)PDQuest 8.0軟件分析，純種的單2號(hào)大麥對(duì)比純種的甘啤4號(hào)大麥明顯缺失2種蛋白質(zhì)，即圖1中方框內(nèi)所示蛋白質(zhì)點(diǎn)。由此可見(jiàn)，不同品種大麥間的蛋白質(zhì)種類(lèi)差異性是比較顯著的。根據(jù)這一差異性，將2種大麥經(jīng)過(guò)人工混合得到純度為100%、80%、65%、40%、18%、0%的甘啤4號(hào)大麥樣品進(jìn)行雙向電泳分析，結(jié)果如圖2所示。將2種大麥間的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)標(biāo)注為1號(hào)點(diǎn)和2號(hào)點(diǎn)(圖2)。從圖2(A～E)中各圖可清楚的看出不同品種純度的大麥在1、2兩點(diǎn)處的大小和顏色深淺程度的差異，這說(shuō)明蛋白點(diǎn)1和2是甘啤4號(hào)和單2大麥主要的差異點(diǎn)，并且其主要存在于甘啤4號(hào)大麥中，它們的有無(wú)及含量可以代表不同純度的甘啤4號(hào)大麥。

圖2 不同純度大麥差異蛋白點(diǎn)1、2的變化Fig.2 Comparison of plot 1and 2 in different purity barley

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜3D高度與甘啤4號(hào)大麥純度的關(guān)系建立

根據(jù)不同純度間大麥的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)大小及顏色深淺變化，應(yīng)用PDQuest 8.0軟件對(duì)各圖譜的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)1、2生成3D圖(如圖3、圖4所示)進(jìn)一步分析其差異性。

圖3 不同大麥純度下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)1的3D圖Fig.3 3D visual comparison of plot 1 from different purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

圖4 不同大麥純度下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)2的3D圖Fig.4 3D visual comparison of plot 2 from different purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

不同純度甘啤4號(hào)大麥差異蛋白質(zhì)點(diǎn)3D圖高度數(shù)值如表1所示。從圖3和圖4中可以看出，不同大麥純度下的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在雙向電泳圖譜的3D圖中峰高有明顯的差異，并且大麥純度與峰高呈現(xiàn)出一定的線性相關(guān)性，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，其結(jié)果如5和圖6所示。

圖5 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)1的3D圖高度值與大麥純度線性回歸曲線Fig.5 Linear regression curve of 3D values and purity of plot 1

圖6 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)2的3D圖高度值與大麥純度線性回歸曲線Fig.6 Linear regression curve of 3D values and purity of plot 2

由圖5和圖6可知，差異點(diǎn)1的線性回歸方程為y=30.825x2+7.994 9x-0.863 1(R2=0.993 6);差異點(diǎn)2的線性回歸方程為y=13.83x2+19.717x-0.848 7(R2=0.993 5)。2條曲線顯示出大麥純度與峰高之間呈現(xiàn)高度的線性相關(guān)性，并且可以應(yīng)用這兩個(gè)方程檢查混合品種中甘啤4號(hào)大麥的純度。

表1 不同純度甘啤4號(hào)大麥差異蛋白質(zhì)點(diǎn)3D圖高度數(shù)值Table 1 3D values of plot 1 and 2 in different purity Ganpi 4 barley

2.3 應(yīng)用已知純度大麥檢驗(yàn)回歸方程的準(zhǔn)確性

為了驗(yàn)證2.2中所得到方程的準(zhǔn)確性，另取混入單2號(hào)大麥的甘啤4號(hào)大麥，得到純度為50%和80%的甘啤4號(hào)大麥樣品，并進(jìn)行雙向電泳，得到其差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的雙向電泳圖譜3D圖如圖7所示。

圖7 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)3D圖Fig.7 3D visual comparison of plot 2 from 50%and 80%purity Ganpi 4 barley using PDQuest 8.0 software

純度為50%的大麥樣品中，差異蛋白質(zhì)點(diǎn)1的高度為1.3，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為49%，誤差為1%;差異蛋白質(zhì)點(diǎn)2的高度為1.1，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為45.2%，誤差為4.8%。純度為80%的大麥樣品中，差異蛋白質(zhì)點(diǎn)1的高度為1.8，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為79.4%，誤差為0.6%;差異蛋白質(zhì)點(diǎn)2的高度為1.5，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得純度為80.5%，誤差為0.5%。由此可見(jiàn)，該方程具有較高的準(zhǔn)確性。因此，可以利用差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的3D高度數(shù)值來(lái)檢測(cè)大麥樣品的純度。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)甘啤4號(hào)和單2號(hào)2種大麥人工混和后所得到的不同純度大麥種子進(jìn)行雙向電泳并進(jìn)行圖譜分析，找出了2種大麥品種間的主要差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，得到了各差異點(diǎn)的3D高度數(shù)值，應(yīng)用該數(shù)值與大麥純度進(jìn)行線性擬合，得到了不用差異蛋白質(zhì)點(diǎn)相關(guān)的線性回歸方程。同時(shí)，運(yùn)用該方程對(duì)純度為50%和80%的甘啤4號(hào)大麥種子的純度進(jìn)行檢測(cè)以考察其準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)取得了良好的效果，由此說(shuō)明利用雙向電泳技術(shù)可以檢驗(yàn)大麥種子的純度。

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