固定化葡萄糖異構(gòu)酶的微波活化及其性質(zhì)研究*

張甫生，胡國(guó)洲，田美玲，李曼珊，闞建全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose isomerase，簡(jiǎn)稱 GI)，能將D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖，是工業(yè)上大規(guī)模制備果葡糖漿的關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶［1-2］。因果葡糖漿具有溶解度高、保濕性好、抗結(jié)晶性好及風(fēng)味濃郁等特點(diǎn)，現(xiàn)作為甜味劑已逐步取代了蔗糖的地位［3-4］。隨著果葡糖漿使用量增長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的需求也在不斷增加;然而葡萄糖異構(gòu)酶在應(yīng)用過(guò)程中存在酶活性低、再生困難、壽命短及價(jià)格昂貴等問(wèn)題，極大地限制了其工業(yè)化應(yīng)用，也增加了實(shí)際生產(chǎn)成本，成為制約果葡糖漿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。為此，國(guó)內(nèi)外企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)都迫切地期望通過(guò)酶改性技術(shù)，達(dá)到提高酶活、延長(zhǎng)酶壽命、降低生產(chǎn)用酶量的目的。

近年來(lái)，微波處理等作為食品工業(yè)殺菌與鈍酶的加工手段漸入人們視野［5-6］。在應(yīng)用微波對(duì)酶進(jìn)行處理的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一些較低強(qiáng)度的微波處理能迅速地提高酶的活性，如Yu等對(duì)微波活化脂肪酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與普通加熱相比，480 W的微波處理可使諾維信脂肪酶活性提高1.5倍［7］;Lukasiewicz等研究顯示，微波處理可使γ-淀粉酶的初始反應(yīng)速率最大可提高2.5倍［8］;Roy等研究表明微波的非熱效應(yīng)可使蛋白酶初始反應(yīng)速率提高2.1～4.7倍，同時(shí)與pH及鹽離子等還有協(xié)同增效的作用［9］。此外，微波處理還可以使纖維素酶［10］、S-腺苷高半胱氨酸水解酶［11］、α-半乳糖苷酶［12］及 β-葡糖苷酶［12］等酶的活性增強(qiáng)。這就顯示在適當(dāng)條件下微波處理對(duì)食品中酶具有活化效果，可以對(duì)酶進(jìn)行活化改性，來(lái)提高酶活。但上述這些激活研究大多集中于對(duì)單一游離酶活性提高方面，未進(jìn)一步涉及其酶學(xué)性質(zhì)等方面變化。

在微波處理對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶活化方面，除本團(tuán)隊(duì)前期報(bào)道微波處理激活游離葡萄糖異構(gòu)酶［13］外，目前尚未見(jiàn)其他相關(guān)的研究報(bào)道。因酶在經(jīng)過(guò)固定化之后，固定化酶的活性中心、空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生改變［2，4］，微波處理對(duì)固定化后葡萄糖異構(gòu)酶的影響也定會(huì)有所改變。因此，本文以固定化葡萄糖異構(gòu)酶為研究對(duì)象，探討微波處理對(duì)其活性及相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的影響，以期為微波處理對(duì)固定化酶活化改性提供理論基礎(chǔ)，并推動(dòng)微波處理等非熱加工技術(shù)在酶改性領(lǐng)域中的合理應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖異構(gòu)酶(≥10萬(wàn)U/g)，武漢銀河化工有限公司;固定化葡萄糖異構(gòu)酶，以活化硅膠為載體自制(酶活125 U/g)。

咔唑、半胱氨酸鹽酸鹽、葡萄糖、Na2HPO4、NaH2PO4、果糖、H2SO4、高氯酸、MgSO4、CoCl2等均為分析純，成都科龍?jiān)噭┯邢薰?硅膠(300目)，青島海洋化工廠分廠。

1.2 設(shè)備與儀器

MAS-Ⅱ型微波快速制樣系統(tǒng)(工作功率0～1 000 W，工作溫度25～250℃)，上海新儀公司;UV-2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司;PB-10精密pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FA2004型電子天平，上海精科天平;SHZ-82A恒溫水浴振蕩器，江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司;DK-8D型三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備

取5 mg/mL葡萄糖異構(gòu)酶酶液30 mL，加入1 g干燥活化硅膠(硅膠活化參考 Song的方法［14］)，于25℃水浴振蕩器(170 r/min)中振蕩24 h，然后用去離子水充分洗滌，抽濾得到固定化葡萄糖異構(gòu)酶樣品，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活力測(cè)定

采用半胱氨酸-咔唑法［3］。反應(yīng)體系為:0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液10 mL，2 mol/L的葡萄糖混合溶液10 mL(含有0.05 mol/L Mg2+和0.01 mol/L Co2+，下同)，0.4 g固定化酶。混合液置于70℃水浴中，反應(yīng)30 min后，迅速加入0.5 mol/L的高氯酸溶液2.5 mL終止反應(yīng)，后用半胱氨酸-咔唑法測(cè)定果糖含量，根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算固定化葡萄糖異構(gòu)酶的酶活力。固定化酶酶活力單位定義:在該反應(yīng)條件下，1 g固定化酶每分鐘將1 μmol葡萄糖異構(gòu)為果糖的微摩爾數(shù)為1個(gè)活力單位(U/g)。

1.3.3 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL 2 mol/L的葡萄糖底物混合溶液為待處理液(均以pH 7.0緩沖液配制，下同)，以水浴加熱處理為對(duì)照，并以其酶活為100%，在微波處理溫度70℃和處理時(shí)間30 min的條件下，探討不同功率(200、300、400、600、800 W)微波處理對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響。

1.3.4 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度的影響

在固定微波處理功率400 W和處理時(shí)間30 min的條件下，探討不同微波處理溫度(55、65、70、75、80、85、90℃)對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應(yīng)溫度。

1.3.5 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適pH的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時(shí)間30 min的條件下，探討不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0)對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以最大酶活力為100%，分析其最適反應(yīng)pH。

1.3.6 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的Km值與Vmax的影響

以10 mL 2%固定化酶+10 mL一系列濃度(100、300、500、800、1 000、1 500 mmol/L)的葡萄糖底物混合溶液為待處理液，以水浴加熱處理為對(duì)照，在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時(shí)間30 min的條件下進(jìn)行微波處理，測(cè)定固定化酶活性。根據(jù)經(jīng)典的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程，運(yùn)用Lineweaver-Burk作圖［3］(雙倒數(shù)法)得到米氏方程，進(jìn)而利用米氏方程計(jì)算微波加熱處理?xiàng)l件下葡萄糖異構(gòu)酶的Km和Vmax。

1.3.7 金屬離子濃度對(duì)微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時(shí)間30 min的條件下，探討底物溶液中不同Mg2+濃度(0、0.001、0.01、0.05、0.08、0.1 mol/L)和Co2+濃度(0、0.001、0.001、0.002、0.005、0.01 mol/L)對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響，以水浴對(duì)照初始酶活力為100%，比較分析底物中最適Mg2+和Co2+濃度。

1.3.8 微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性分析

(1)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性分析

在固定微波處理功率400 W，處理溫度為30～90℃條件下保溫處理酶液1 h，冷卻到4℃后，測(cè)定固定化酶酶活，以最大酶活力為100%。分析比較微波加熱處理和水浴加熱對(duì)照處理下固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性。

(2)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析

在固定微波處理功率400 W、處理溫度70℃和處理時(shí)間30 min的條件下進(jìn)行微波處理，測(cè)定固定化酶活性。而后將固定化酶收集，用去離子水洗滌干凈，置于4℃冰箱保存4 h后，再用同樣的方法進(jìn)行微波加熱處理并測(cè)定其活性。重復(fù)試驗(yàn)15次，以初始酶活力為100%，比較固定化酶在微波加熱和水浴加熱條件下酶的操作穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用OriginPro 8.0和Excel 2010進(jìn)行分析處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響

由圖1可知，固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性在不同功率微波處理后，酶活力均有所提高，說(shuō)明固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理的條件下均被活化;但酶活力增幅呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，微波功率為200～400 W時(shí)，固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性上升，并在400 W時(shí)達(dá)到最高為156.1 U/g，比對(duì)照水浴處理酶活(125.4 U/g)增加了24.5%;而當(dāng)微波功率增至600 W、800 W時(shí)，固定化酶酶活增幅降低，與對(duì)照相比酶活分別僅增加18.0%和15.5%。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚砉β适姑钢心承┡c酶活力相關(guān)的功能基團(tuán)發(fā)生有序重排，從而使酶活力提高，而過(guò)高的處理功率使酶蛋白部分變性，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性降低或增幅降低［7］。

圖1 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性增強(qiáng)的影響Fig.1 Effect of microwave treatment on enhancing activity of immobilized glucose isomerase

2.2 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適反應(yīng)溫度的影響

溫度是影響葡萄糖異構(gòu)酶活性的一個(gè)重要因素，在適宜的溫度范圍內(nèi)，葡萄糖異構(gòu)酶比較穩(wěn)定，當(dāng)偏離最適溫度后，酶就會(huì)發(fā)生熱變性而導(dǎo)致失活［15］。微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適反應(yīng)溫度的影響Fig.2 Effect of microwave treatment on optimal temperature of immobilized glucose isomerase

從圖2可以看出，微波處理與水浴對(duì)照處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度分別為75℃和80℃;與水浴對(duì)照相比，在微波處理下固定化酶的最適反應(yīng)溫度降低了5℃，且其最適溫度范圍(酶活＞95%的溫度范圍)變小，水浴處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度范圍為75～85℃，而微波處理后固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適溫度范圍為75～80℃;這與前期游離酶的研究結(jié)果［13］正好相反，這可能與載體對(duì)固定化酶蛋白的保護(hù)作用有關(guān)，載體對(duì)酶蛋白分子構(gòu)象完整性自動(dòng)進(jìn)行調(diào)整［1-2］，阻礙了微波處理對(duì)酶結(jié)構(gòu)的有序重排或加速無(wú)序結(jié)構(gòu)，從而使最適反應(yīng)溫度與最適溫度范圍降低。而同時(shí)在較高的反應(yīng)溫度范圍(80～90℃)內(nèi)，微波處理固定化酶的活力比對(duì)照處理下降較快，可能是在高溫條件下，微波處理更易使部分固定化葡萄糖異構(gòu)酶失活所致［16］。

2.3 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適pH的影響

pH能影響酶分子活性部位上酸性或堿性氨基酸側(cè)基的解離狀態(tài)，從而影響酶活性中心與底物的結(jié)合或催化，進(jìn)而影響酶活性［17］;pH是影響酶活性的重要因素之一，當(dāng)介質(zhì)的pH值對(duì)最適宜值偏離較大時(shí)，還可導(dǎo)致酶的變性失活。由圖3可以看出，微波處理并未改變固定化葡萄異構(gòu)酶的最適pH范圍，微波處理和水浴處理的固定化葡萄異構(gòu)酶的最適pH范圍均為7.0～7.5，且均在pH7時(shí)酶活力最高。

圖3 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶最適pH的影響Fig.3 Effect of microwave treatment on optimal pH of immobilized glucose isomerase

2.4 金屬離子濃度對(duì)微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響

葡萄糖異構(gòu)酶為金屬離子依賴性酶，其活性中心有Mg2+、Co2+的結(jié)合位點(diǎn)，在適宜的Mg2+、Co2+濃度條件下，葡萄糖異構(gòu)酶分子具有最佳的穩(wěn)定構(gòu)象和最高的活性［4］。不同金屬離子濃度對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的影響，見(jiàn)圖4(a)與4(b)。

從圖4(a)與4(b)中可以看出，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性均隨Mg2+與Co2+濃度增加，呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。對(duì)于Mg2+而言，微波處理與水浴對(duì)照處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性在Mg2+濃度為0.001～0.05 mol/L時(shí)，活性隨Mg2+濃度增加而增加，濃度大于0.05 mol/L，酶活性趨于穩(wěn)定;對(duì)于Co2+而言，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性在Co2+濃度為0～0.001 mol/L時(shí)，活性隨Co2+濃度的增加而增加;濃度大于0.001 mol/L時(shí)，酶活性趨于穩(wěn)定。因此，微波處理與水浴對(duì)照處理的最適Mg2+與Co2+濃度分別為0.05 mol/L和0.001 mol/L。此外，從圖4(a)與4(b)中也可以看出，微波處理固定化酶的活性均較水浴對(duì)照處理高，這與2.1結(jié)果一致，再次證明微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶有活化作用。

圖4 Mg2+(a)和Co2+(b)濃度對(duì)微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性的影響Fig.4 Effect of Mg2+(a)and Co2+(b)on the activity of immobilized glucose isomerase treated by microwave

2.5 微波處理對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響

由經(jīng)典的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程，作圖法可得到米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vmax)。經(jīng)作圖(圖5a與5b)與計(jì)算得出，微波處理下固定化葡萄糖異構(gòu)酶的Km為0.181 mol/L，Vmax為 8.1 ×10-4mol/(L·min);水浴對(duì)照處理固定化酶的Km為0.223 mol/L，Vmax為7.7×10-4mol/(L·min)。說(shuō)明經(jīng)微波處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶與水浴對(duì)照處理的相比Vmax增大，Km降低，說(shuō)明此時(shí)酶與底物親和力增大，其在飽和濃度下的限制反應(yīng)速度也增大。這可能是由于微波處理導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化，使酶的底物的親和力增加，葡萄糖異構(gòu)酶與底物結(jié)合更容易，從而表現(xiàn)較高的催化能力［9，18］。

圖5 微波處理(a)和水浴處理(b)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)方程圖Fig.5 Michaelis-Menten kinetics equation of immobilized glucose isomerase treated by microwave(a)and conventional heating(b)

2.6 微波處理固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性分析

(1)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性分析

溫度它不僅可以影響酶蛋白的構(gòu)象、參與酶促反應(yīng)官能團(tuán)的解離狀態(tài)，而且還會(huì)影響到酶與底物的親和力，酶-底物絡(luò)合物的分解，甚至還會(huì)影響到酶與激活劑的親和力等，且與pH值等相比，在加工過(guò)程更不易控制［19］。固定化酶的熱穩(wěn)定性是其在工業(yè)化應(yīng)用中最重要的性質(zhì)之一。固定化酶熱穩(wěn)定性比較分析見(jiàn)圖6，從圖6可以看出，微波加熱條件下，固定化酶在70℃以下時(shí)，其殘余酶活也都是保持在80%以上，呈持續(xù)上升狀態(tài);而當(dāng)溫度大于70℃后，固定化酶的殘余酶活急劇下降，在90℃下降到55.54%;而在水浴加熱對(duì)照條件下，固定化酶在80℃以下時(shí)，其殘余酶活都是保持在80%以上，也呈持續(xù)上升狀態(tài)，當(dāng)溫度大于80℃后，固定化酶活力也開始迅速下降，在90℃下降到81.44%。說(shuō)明在較低溫度 (微波處理＜70℃，水浴處理＜80℃)時(shí)，固定化酶的穩(wěn)定性較好;而在較高溫度下(微波處理＞70℃，水浴處理＞80℃)時(shí)，固定化酶活穩(wěn)定性不高且酶活開始急劇下降;而在更高溫度90℃時(shí)，微波加熱固定化酶活比對(duì)照水浴處理下降得更多，穩(wěn)定性顯著低于對(duì)照處理固定化酶活，說(shuō)明高溫微波加熱對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性有顯著的影響，這可能是由于在高溫下微波促進(jìn)了酶從載體脫落減少了載體保護(hù)作用或微波其他非熱效應(yīng)所導(dǎo)致［11，16］?？傮w說(shuō)來(lái)，雖然微波處理顯著地降低了固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高溫中的穩(wěn)定性，但在＜70℃時(shí)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)良好且在一定范圍內(nèi)優(yōu)于水浴對(duì)照處理。

圖6 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理下的熱穩(wěn)定性分析Fig.6 Thermal stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

(2)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析

固定化酶的操作穩(wěn)定性也是其在工業(yè)化應(yīng)用中最重要的性質(zhì)之一［20］。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的操作穩(wěn)定性分析結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在微波處理下的操作穩(wěn)定性分析Fig.7 Operating stability of immobilized glucose isomerase treated by microwave

從圖7可以看出，固定化酶在使用次數(shù)較少時(shí)，表現(xiàn)出的較好的穩(wěn)定性;在使用6次前，微波加熱處理與水浴對(duì)照處理的酶活均保持在80%以上，在第6次使用時(shí)，兩種處理酶活分別為85.66%和91.35%。但隨著使用次數(shù)的增多，相對(duì)酶活緩慢地下降，在使用7次到15次之間時(shí)，酶活基本呈線性下降的趨勢(shì)，在使用15次后，兩種處理酶活分別為30.38%和41.66%。從總體上的變化趨勢(shì)來(lái)看，微波處理并未顯示改變固定化酶的操作穩(wěn)定性;后期隨著使用次數(shù)增多(＞10次)，微波處理固定化酶操作穩(wěn)定性降低、酶活損失較大，這可能是由于多次微波處理易導(dǎo)致酶變性引起的［21］?？偟谜f(shuō)來(lái)，微波處理的固定化葡萄糖異構(gòu)酶仍具有較好的操作穩(wěn)定性，也能夠滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，但比水浴加熱條件下操作穩(wěn)定性要略差些。

3 結(jié)論

不同微波功率對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的活性增強(qiáng)程度不同，與水浴對(duì)照相比，在最佳微波處理?xiàng)l件下，酶固定化葡萄糖異構(gòu)酶活性可增加24.50%，說(shuō)明適宜微波處理用于激活酶是可行的。在此活化過(guò)程中，微波處理降低固定化葡萄糖異構(gòu)酶Km，增大Vmax，但對(duì)其最適 pH和最適金屬離子濃度幾乎沒(méi)有影響;同時(shí)微波處理在一定程度上降低了固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)溫度范圍及高溫的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性，但這些參數(shù)依舊較為理想，能夠滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。

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