己酮可可堿預(yù)處理對(duì)硫代乙酰胺致大鼠急性肝損傷的影響

羅妙莎，董 蕾，郭曉燕，李 晶，秦 斌(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710004;通訊作者，E-mail:dong556@126.com)

急性肝損傷(acute liver injury)是由多種原因引發(fā)肝細(xì)胞炎癥壞死，肝臟的解毒、合成、排泄、生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生障礙，引起以凝血功能障礙、黃疸、腹水、肝性腦病等癥狀為特征的臨床綜合征。目前多采取綜合治療，包括去除病因、對(duì)癥支持、調(diào)節(jié)免疫功能以及防治各種并發(fā)癥的發(fā)生等［1］，但療效均不滿意。己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)是甲基黃嘌呤的衍生物，是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，其具有改善血流動(dòng)力學(xué)、改善組織細(xì)胞功能、抗炎、抗氧化以及抗纖維化等作用。研究表明，己酮可可堿對(duì)酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纖維化均有一定的治療作用［2-4］，但其對(duì)急性肝損傷作用的研究則較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在利用不同劑量己酮可可堿對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷的影響并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體重(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)08-018。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心管理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.1.2 藥品與試劑 己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)、硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，聯(lián)苯雙酯(bifendate)購(gòu)自北京協(xié)和制藥廠，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及給藥方案 普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠1周，自由飲食飲水，溫度為20-25℃，濕度為(50±5)%，光照周期為12 h∶12 h。1周后隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組，急性肝損傷模型組，聯(lián)苯雙酯［100 mg/(kg·d)］陽(yáng)性對(duì)照組，己酮可可堿低［50 mg/(kg·d)］、中［100 mg/(kg·d)］、高［200 mg/(kg·d)］劑量干預(yù)組，每組10只，雌雄各半。給藥方案:從實(shí)驗(yàn)第1天起，低、中、高劑量干預(yù)組大鼠分別給予 PTX 50，100，200 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)［5］，陽(yáng)性藥物組給予聯(lián)苯雙酯100 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)，模型組及正常組給予蒸餾水10 ml/(kg·d)灌胃，連續(xù)10 d;實(shí)驗(yàn)第11天，模型組、陽(yáng)性藥物組及低、中、高劑量干預(yù)組給予TAA 300 mg/kg腹腔注射［6］，正常組給予等體積生理鹽水7.5 ml/kg腹腔注射。24 h后，給予10%的水合氯醛3-4 ml/kg腹腔注射麻醉處死各組大鼠。

1.2.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 大鼠麻醉后開(kāi)腹，常規(guī)腹主動(dòng)脈取血5 ml，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

1.2.3 肝組織指標(biāo)檢測(cè) 取相同部位的肝左葉組織，在冰生理鹽水中漂洗后，濾紙拭干，用組織勻漿器將肝組織制成10%的勻漿，離心后取上清，測(cè)定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量，以上各指標(biāo)的測(cè)定操作步驟均按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查 取肝組織做橫斷面取材，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用±s表示，在滿足正態(tài)性及方差齊性的條件下，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn);不滿足正態(tài)性和方差齊性的條件時(shí)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中ALT、AST的含量

與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及中、高劑量干預(yù)組血清ALT、AST均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，低劑量干預(yù)組ALT、AST雖有所下降，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與陽(yáng)性藥物組相比，中、高劑量干預(yù)組血清 ALT、AST差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠血清中ALT、AST的濃度比較Figure 1 The serum contents of ALT and AST in each group

2.2 肝組織中MDA、SOD、GSH的含量

與正常組相比，模型組小鼠肝組織勻漿中MDA水平顯著升高，同時(shí)SOD、GSH水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組相比，陽(yáng)性藥物組及中、高劑量干預(yù)組MDA均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，SOD、GSH 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量干預(yù)組雖MDA下降且SOD、GSH水平升高，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與陽(yáng)性藥物組相比，中、高劑量干預(yù)組肝組織中MDA、SOD、GSH的含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，見(jiàn)圖2)。

2.3 肝組織病理學(xué)檢查

2.3.1 肉眼觀察 正常組大鼠肝臟外觀呈現(xiàn)深紅色，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，富有彈性;模型組及低劑量干預(yù)組大鼠肝臟表面有瘀血點(diǎn)，肝臟包膜無(wú)光澤;陽(yáng)性藥物組及中、高劑量干預(yù)組肝臟變化介于上述兩種表現(xiàn)之間，較模型組肝臟變化明顯好轉(zhuǎn)。

2.3.2 光鏡下觀察 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心呈現(xiàn)放射狀排列，肝索排列整齊，肝細(xì)胞無(wú)變性及壞死，肝小葉及匯管區(qū)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，炎性細(xì)胞浸潤(rùn);陽(yáng)性藥物組及中、高劑量干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞水腫較輕;低劑量干預(yù)組肝組織鏡下表現(xiàn)介于以上兩種表現(xiàn)之間(圖3，見(jiàn)第502頁(yè))。

圖2 各組大鼠肝組織勻漿中MDA、SOD、GSH的濃度比較Figure 2 The contents of MDA，SOD and GSH in liver tissues of each group

3 討論

急性肝損傷時(shí)引發(fā)肝細(xì)胞炎癥或壞死，并繼發(fā)后續(xù)一系列病理過(guò)程，因而保護(hù)肝細(xì)胞，可減少各種有害因素對(duì)肝臟的損傷。己酮可可堿(PTX)是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，因其具有擴(kuò)血管、改善微循環(huán)、改善細(xì)胞缺氧、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用，已被研究證實(shí)能有效預(yù)防和改善腦缺血、肺纖維化、肝纖維化、脂肪肝、酒精性肝病等疾?。?］。本研究通過(guò)硫代乙酰胺(TAA)復(fù)制急性肝損傷模型，證實(shí)己酮可可堿預(yù)處理對(duì)大鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷與人類(lèi)肝損傷特點(diǎn)較為接近，能很好地反映人類(lèi)肝損傷實(shí)際的情況。TAA可使血清ALT、AST水平顯著升高，病理學(xué)提示肝細(xì)胞變性壞死，肝臟病理學(xué)變化也較為均一［8］，因此被廣泛應(yīng)用于肝損傷的機(jī)制研究中。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，模型組血清中AST、ALT含量及肝組織中MDA水平明顯升高，而肝組織中SOD、GSH水平顯著降低(P＜0.01);肝臟病理學(xué)檢查提示，模型組肝臟結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這與以往研究中 TAA造模的結(jié)果相一致［6］，提示本實(shí)驗(yàn)中TAA誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型是可行的。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)通常存在于正常肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損破裂時(shí)外排入血，是常用的反映肝實(shí)質(zhì)損傷的酶學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，PTX中、高劑量預(yù)處理干預(yù)后，大鼠血清AST、ALT水平顯著降低。肝組織病理學(xué)檢查證實(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞水腫減輕，效果與聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性藥物對(duì)照組接近，提示PTX預(yù)處理可有效減輕TAA誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，且具有一定的劑量依賴性。此外，既往研究證實(shí)己酮可可堿還可有效改善慢性肝損傷的肝臟病理變化，延緩慢性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)慢性肝損傷也有一定的治療作用［9，10］。

急性肝損傷發(fā)生的機(jī)制頗為復(fù)雜，各種有害因素作用于肝臟，產(chǎn)生有毒中間代謝產(chǎn)物損傷肝臟，例如改變細(xì)胞膜的完整性、細(xì)胞線粒體功能失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)外離子濃度變化、降解肝酶的活性、自由基的作用等，同時(shí)也可誘發(fā)免疫機(jī)制，通過(guò)補(bǔ)體、細(xì)胞因子及免疫變態(tài)反應(yīng)等產(chǎn)生損傷，以往的研究顯示，氧化應(yīng)激在肝損傷中發(fā)揮著重要作用［11］。氧化應(yīng)激是由于自由基生成與清除平衡被破壞，導(dǎo)致自由基及其代謝產(chǎn)物蓄積，這些自由基可激活磷脂酶發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，致使過(guò)氧化的終產(chǎn)物MDA等增加，體內(nèi)抗氧化及抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用成分如SOD、GSH等含量下降，造成肝細(xì)胞變性壞死，肝功能受損［12］。因此，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)MDA、SOD及GSH的含量，可以反映機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究顯示，PTX可促進(jìn)氧化和抗氧化機(jī)制平衡的恢復(fù)，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能恢復(fù)正常［5，13-15］。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，PTX中、高劑量預(yù)處理能夠增加大鼠肝組織中SOD及GSH水平并顯著降低MDA含量。因此我們推測(cè)PTX可能通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化劑活性，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用，改善體內(nèi)自由基生成和清除系統(tǒng)的平衡狀態(tài)，從而減輕肝細(xì)胞的損傷，對(duì)急性肝損傷大鼠起到一定保護(hù)作用。但本研究中并未涉及己酮可可堿增強(qiáng)急性肝損傷中抗氧化應(yīng)激作用的具體機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果顯示，PTX可通過(guò)清除體內(nèi)過(guò)多自由基及減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減少肝細(xì)胞的損傷，改善肝組織的病理變化，從而對(duì)急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展起到一定的抑制作用。綜上所述，PTX具有治療急性肝損傷的潛在價(jià)值，為應(yīng)用于臨床治療急性肝損傷提供了理論依據(jù)。

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