MicroRNA-17家族真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響

王曉霏，孫宏飛，陳妍珂，趙凌宇，楊 陽(yáng)，宋土生，黃 辰，(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 7006;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心;通訊作者，E-mail:hchen@mail.xjtu.edu.cn)

microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，它通過(guò)與靶基因3’UTR區(qū)結(jié)合抑制基因表達(dá)［1］，從而參與調(diào)控眾多的生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及發(fā)育、器官形成等?，F(xiàn)已知道的人類基因組編碼的miRNA已超過(guò)1 000個(gè)［2］，我們把種子區(qū)(seed regions)具有相同序列，并且在組織表達(dá)狀況一致的miRNAs劃分為同一個(gè)家族(family)［3］。miRNAs 在染色體上不是隨機(jī)排列的，其中有一些是依次相對(duì)緊密地聚集在一起，我們把這種聚集在一起的miRNAs稱作簇(cluster)，這種簇生排列的miRNAs常常協(xié)同表達(dá)［4］。miR-17 家族包括 miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93、miR-106a、miR-106b 六個(gè)成員。其中miR-17、miR-20a位于十三號(hào)染色體屬于miR-17-92簇;miR-106a、miR-20b位于 X染色體屬于miR-106a-363簇;miR-106b、miR-93位于七號(hào)染色體屬于 miR-106b-25簇。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17、miR-20a在非霍奇金淋巴瘤中活化突變，并且在多種類型的腫瘤中過(guò)表達(dá)［5-7］。miR-20b在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)［8］，miR-93 在結(jié)腸癌中高表達(dá)［9］。miR-106a在胃癌中高表達(dá)，且促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移［10］;而在星狀細(xì)胞瘤中低表達(dá)，并與患者生存期短、預(yù)后差正相關(guān)［11］。miR-106b在肝癌中高表達(dá)［12］，并已經(jīng)明確miR-106b通過(guò)靶向P21從而調(diào)控細(xì)胞周期［13］。可以看出 miR-17家族的表達(dá)變化，能夠影響多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及功能。

本研究擬構(gòu)建miR-17家族的真核表達(dá)載體，鑒定其在人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)，探究miR-17家族對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響，為探索miR-17家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR 質(zhì)粒 (Invitrogen公司);菌株選用本室保存的Top10菌株;氨芐青霉素(新泰生物公司);T4 DNA連接酶及Eco RⅠ、Hin dⅢ(TaKaRa公司);DNA無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司);膠回收試劑盒(TIANGEN公司);轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent(Invitrogen公司);RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit和real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自TaKaRa公司;PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)合成 miR-17家族寡聚核苷酸 在miRbase(http://mirbase.org/)網(wǎng)站查詢 miR-17家族的前體序列，選擇成熟體表達(dá)量多的5p作為合成序列，并分別在兩端添加Eco RⅠ和Hin dⅢ的酶切位點(diǎn)(見(jiàn)表1)委托上海生工生物工程股份有限公司合成以上單鏈核酸，將各單鏈核酸稀釋至100 μmol/L，65℃退火5 min形成DNA雙鏈，-20℃保存待用。

表1 miR-17家族添加了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的序列Table 1 The sequences of miR-17 family inserted with enzyme digestion sites of EcoRⅠand HindⅢ at the two ends

1.2.2 載體構(gòu)建 用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶切pcDNA6.2-GW/Em-GFP-miR質(zhì)粒，然后用1%瓊脂糖凝膠分離雙酶切目的產(chǎn)物，用膠回收試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作回收大片段DNA。用T4 DNA連接酶連接目標(biāo)片段和酶切載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌，挑克隆，用Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切鑒定，選擇陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含1%雙抗和10%胎牛血清(購(gòu)自Gibco)的DMEM(購(gòu)自PAA)中。放置于37℃ 5%CO2的孵育箱，隔天換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按2×105個(gè)/孔細(xì)胞鋪6孔板，24 h后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染體系參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū))。將轉(zhuǎn)染pcDNA6.2空載體的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-17家族真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染4 h后換液。

1.2.4 real-time PCR檢測(cè)miR-17家族瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的表達(dá) Trizol提取SMMC-7721細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒對(duì)所提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCt法分析 real-time PCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中對(duì)照組為轉(zhuǎn)染了pcDNA6.2空載體的SMMC-7721細(xì)胞的總RNA，測(cè)得miR-17家族的表達(dá)數(shù)值;實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染了miR-17家族表達(dá)載體的SMMC-7721細(xì)胞總RNA，測(cè)得miR-17家族的表達(dá)數(shù)值，最終數(shù)值以對(duì)照組作為1，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的倍數(shù)關(guān)系展示。

表2 Real-time PCR所用引物序列Table 2 Real-time PCR primer sequences

1.2.5 CCK8增殖實(shí)驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔種約3 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA6.2空載體，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-17家族。在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后從培養(yǎng)箱取出加入CCK8試劑(購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)，利用試劑中含有的WST-8［2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽］，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)，所生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比的原理，檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。每孔100 μl培養(yǎng)液中加入10 μl CCK8試劑，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后取出，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔吸光度(A)值，以反映細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS18.0軟件對(duì)所得real-time PCR及CCK8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙酶切及測(cè)序鑒定

構(gòu)建的miR-17家族載體上，miR-17家族片段前后分別有Eco RⅠ、Hin dⅢ的酶切位點(diǎn)(見(jiàn)圖1 A)，酶切位點(diǎn)間的片段大小分別為:miR-17 84 bp;miR-20a 71 bp;miR-106a 81 bp;miR-20b 69 bp;miR-106b 82 bp;miR-93 80 bp。通過(guò)酶切鑒定目標(biāo)片段是否連接到載體上，雙酶切出現(xiàn)兩條帶且符合目的片段大小，表明片段連接成功(見(jiàn)圖1B)。

通過(guò) Chromas軟件和應(yīng)用 NCBI的 BLAST功能，分別將設(shè)計(jì)的miR-17家族序列與測(cè)序結(jié)果比對(duì)。結(jié)果 顯示匹配程度達(dá)100%，證明載體構(gòu)建成功(圖2，見(jiàn)第607 頁(yè))。

圖2 pcDNA6.2-GW/EmGEP-miR-17家族表達(dá)載體構(gòu)建測(cè)序Chromas(左)和Blast(右)比對(duì)結(jié)果Figure 2 The identification of pcDNA6.2-GW/EmGEP-miR-17 family expression vectors by sequencing

2.2 SMMC-7721細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在六孔板中培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的miR-17家族載體。48 h后提取RNA，realtime PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-17家族表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中miR-17家族的表達(dá)量均顯著增加(P ＜0.05，見(jiàn)圖3)。

2.3 過(guò)表達(dá) miR-17家族可促進(jìn)人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞的增殖

轉(zhuǎn)染miR-17家族后檢測(cè)其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響。CCK8結(jié)果顯示(見(jiàn)圖4)，培養(yǎng)24 h、48 h后實(shí)驗(yàn)組中SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力與對(duì)照組相比均有顯著提升(P＜0.05)，提示miR-17家族可促進(jìn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖。

3 討論

miRNA可通過(guò)與mRNA匹配在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因翻譯，導(dǎo)致其靶基因蛋白表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生命活動(dòng)［14］。在不同腫瘤中，即使同一個(gè)miRNA由于靶基因不同，在腫瘤細(xì)胞中所起到的作用可能相反。已有研究表明，過(guò)表達(dá)miR-17-5p能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，其原因是因?yàn)閙iR-17-5p過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)其靶基因E2F1，進(jìn)而下調(diào)基因Wip1。而Wip1被認(rèn)為是p38 MAPK的抑制劑，下調(diào)Wip1能夠激活p38MAPK通路，導(dǎo)致磷酸化的HSP27增多，增進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［15］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在肝癌細(xì)胞中敲除miR-17能夠促進(jìn)p-AKT表達(dá)，增進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且 MMP3是 miR-17的靶基因［16］。

圖1 pcDNA6.2-GW/EmGEP-miR-17家族真核表達(dá)載體的雙酶切電泳鑒定結(jié)果Figure 1 The electrophoresis of pcDNA6.2-GW/EmGEP-miR-17 family expression vectors after double enzyme digestion

圖3 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-17家族轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)水平Figure 3 The expression levels of miR-17 families in SMMC-7721 cells after transfected with pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-17 family

圖4 CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-17家族載體對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響Figure 4 The proliferation effects of transfected miR-17 family vectors in SMMC-7721 cells by CCK8

就簇而言，一個(gè)簇本身與其簇內(nèi)某一miRNA的表達(dá)，在同一腫瘤中也可能起到相反的作用。比如miR-17-92簇在腫瘤中起促癌作用［17］，過(guò)表達(dá)miR-17-92簇能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期減少凋亡［18］。而有報(bào)道表明，過(guò)表達(dá)miR-17能夠抑制細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞黏附與遷移，抑制粘連蛋白和FNDC3A的表達(dá)［19］。miR-106b-25簇有報(bào)道稱其在肝細(xì)胞癌中表達(dá)促癌基因的作用［20］，而在結(jié)腸癌中，miR-93扮演著抑制細(xì)胞增殖和克隆形成的作用［21］。從以上的例子我們可以看出，miRNA的表達(dá)對(duì)腫瘤的影響是復(fù)雜多樣的，不同組織背景、不同研究對(duì)象都會(huì)得到不同結(jié)果。

本研究運(yùn)用目前技術(shù)較為成熟且價(jià)格相對(duì)低廉的miRNA質(zhì)粒真核表達(dá)載體構(gòu)建方法，通過(guò)將經(jīng)Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切和純化后的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表達(dá)載體，連接人工合成的miR-17家族5p寡聚核苷酸，轉(zhuǎn)化至E.coli Top10后經(jīng)DNA測(cè)序、BLAST比對(duì)以及雙酶切電泳驗(yàn)證，結(jié)果表明成功構(gòu)建了miR-17家族真核表達(dá)載體。將構(gòu)建成功的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中48 h通過(guò)real-time PCR發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-17家族特異性表達(dá)載體后的SMMC-7721實(shí)驗(yàn)組中miR-17家族的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。重要的是，通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá) miR-17家族的實(shí)驗(yàn)組中SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力顯著提升，提示miR-17家族可以促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮原癌基因的作用。這與Shan等［19］所報(bào)道的結(jié)果相反，推斷可能是由于不同腫瘤中的靶基因不同或者調(diào)控其表達(dá)的基因不同所致。利用真核表達(dá)載體，外源性地過(guò)表達(dá)miR-17家族，并通過(guò)此手段來(lái)研究其靶基因以及調(diào)控基因，可以為后期深入研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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