大孔樹脂聯(lián)用硅膠柱色譜法富集制備人工蛹蟲草中蟲草素的工藝研究

張莉莉，梁國強(qiáng)，陳偉

（1.蘇州市市立醫(yī)院本部藥劑科門診藥房，江蘇215000；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇215000）

大孔樹脂聯(lián)用硅膠柱色譜法富集制備人工蛹蟲草中蟲草素的工藝研究

張莉莉1，梁國強(qiáng)2，陳偉2

（1.蘇州市市立醫(yī)院本部藥劑科門診藥房，江蘇215000；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇215000）

目的優(yōu)選一種簡單快捷分離制備人工蛹蟲草中蟲草素的工藝。方法首先考察7種不同極性的大孔樹脂，優(yōu)選出最佳吸附樹脂，然后對樹脂富集蟲草素的吸附量、洗脫劑濃度、洗脫體積等工藝進(jìn)行考察，最后對硅膠柱洗脫劑比例等條件進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳的硅膠柱分離洗脫劑。結(jié)果根據(jù)實驗考察數(shù)據(jù)得出最佳工藝條件：大孔樹脂型號為HPD-D，樹脂對蟲草提取液（0.1 mg/mL）的吸附量為2樹脂床體積（2BV），用20%乙醇，洗脫體積為3BV可將蟲草素洗脫完全，硅膠柱洗脫劑為乙酸乙酯∶丙酮（2∶1），分離制得蟲草素晶體純度約為93.60%。結(jié)論優(yōu)選出的人工蛹蟲草中蟲草素的富集分離工藝簡單快捷，適用于大規(guī)模生產(chǎn)制備蟲草素。

蟲草素/分析；冬蟲夏草/化學(xué)；色譜法，高壓液相；樹脂類，合成

蛹蟲草，又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬異種[1]。蛹蟲草內(nèi)含有蟲草素、蟲草酸、多糖、腺苷等多種有效成分?！缎氯A本草綱要》稱，蛹草有益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰的功能[2-3]。有藥理研究表明，蟲草素是一種腺苷類活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、干擾人體RNA及DNA合成，明顯抑制多種腫瘤生長的作用[4-7]。

目前對蟲草素的分離制備主要采用單一硅膠色譜法，分離較困難，無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，本研究考查不同型號大孔吸附樹脂對蟲草素的吸附效果，并首先用大孔樹脂對人工蛹蟲草中蟲草素進(jìn)行富集，聯(lián)用硅膠柱色譜對蟲草素分離制備，降低蟲草素的分離難度，為蟲草素大規(guī)模生產(chǎn)制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人工蛹蟲草購置于南通市海安縣泓壽生物科技有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為人工蛹蟲草。大孔樹脂D101、HPD-417、HPD-600、AB-8、HPD-800、HPD-100、HPD-D均購于河北滄州寶恩吸附樹脂廠，薄層層析硅膠HG/T2354-92為化學(xué)純，購于青島海洋化工有限公司。加壓層析柱（40 cm×6cm，瑞士BUCHI公司），廣性pH試紙（上?；瘜W(xué)試劑總廠），試劑均為分析純，BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司），Aglient1110型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 方法

1.2.1 大孔樹脂預(yù)處理在容器內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積0.4～0.5倍的乙醇，然后將新樹脂各自投入浸泡24 h左右，使其充分溶脹[8-9]。取出需要質(zhì)量的樹脂裝在柱中備用，然后用每小時2樹脂床體積（2 bed volume，2BV）乙醇淋洗樹脂，每淋洗0.5BV取樣1次，洗至流出液加入少量蒸餾水不出現(xiàn)白色混濁為止[8-10]。并用蒸餾水以同樣的流速洗凈乙醇。再用2BV的2%氫氧化鈉溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，再用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH呈中性。然后用2BV的2%鹽酸溶液，以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2～4 h，最后用蒸餾水以同樣流速洗至出水pH呈中性。

1.2.2 蛹蟲草提取液制備取人工蛹蟲草藥材2 kg，粉碎成粗粉，過60目篩，8倍量的水連續(xù)回流提取2次，每次2 h，抽濾，合并濾液，將合并后的濾液用蒸餾水分散至生藥量約為0.1 g/mL的溶液，用3 mol/L氫氧化鈉溶液將蟲草水分散液調(diào)pH值至10。

1.2.3 蟲草素測定采用高效液相色譜（HPLC）法檢測[10]，檢測流動相為15%甲醇∶85%水（0.05%二乙胺），檢測波長260 nm，流速1.0 mL/min，色譜柱Kromasil C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫30℃。

1.2.4 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC測定精確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解后并定容至刻度，進(jìn)行HPLC檢查，采用面積歸一化法計算峰面積。

1.2.5 大孔吸附樹脂吸附條件的考察

1.2.5.1 大孔樹脂型號的篩選分別精密稱取預(yù)處理好的大孔吸附樹脂D101、HPD-417、HPD-600、HPD-D、AB-8、HPD-800、HPD-100各200 g置于100 mL帶塞錐形瓶中，分別加入升麻提取液（0.1 g/mL）50 mL，靜置過夜，過濾，取藥材提取液與濾液的續(xù)濾液進(jìn)行HPLC檢測蟲草素的含量，以蟲草素的含量為指標(biāo)來計算各型號樹脂對其靜態(tài)吸附量，考查各型號樹脂對蟲草素的吸附效果。

1.2.5.2 大孔樹脂吸附量的考察取1.2.1項中預(yù)處理大孔樹脂500 g裝柱，以1.2.2項中蟲草提取液500 mL為1BV，緩慢上樣1BV上樣流出液取樣，0.45 μm微孔濾膜過濾進(jìn)行HPLC檢測，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計算流出液中蟲草素含量。

1.2.5.3 大孔吸附樹脂洗脫劑濃度的考察采用單因素考察，分別考察蟲草素經(jīng)大孔樹脂吸附后，水洗脫，5%乙醇、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇洗脫蟲草素的效果，每種洗脫劑洗脫5BV，各洗脫液0.45 μm微孔濾膜過濾后均進(jìn)行HPLC檢測，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計算洗脫液中蟲草素的含量。

1.2.5.4 蟲草素大孔樹脂洗脫體積的考察采用單因素考察，考察蟲草素經(jīng)大孔樹吸附后，20%乙醇洗脫，1BV洗脫液取樣進(jìn)行HPLC檢測，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計算洗脫液中蟲草素的含量。

1.2.6 蟲草素的大孔樹脂富集預(yù)處理的大孔樹脂裝柱，按2 mL/g樹脂的量進(jìn)行蟲草素的大孔樹脂富集，上樣后先水和5%乙醇各洗脫2BV，洗脫液棄去，20%乙醇洗脫3BV，回收溶劑，得浸膏。

1.2.7 蟲草素的硅膠柱分離條件考察

1.2.7.1 蟲草素分離洗脫劑的考察采用蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行薄層層析，篩選洗脫劑。用HG/T2354-92硅膠板點(diǎn)樣，在不同展開劑中展開，紫外燈下觀察暗斑。選擇Rf值在0.1左右的展開劑[乙酸乙酯∶丙酮（2∶1）]為硅膠柱分離洗脫劑。

1.2.7.2 蟲草素的硅膠柱分離將1.2.6項中浸膏用乙酸乙酯溶解，1.1.5項的比例加入薄層層析硅膠，攪拌均勻后水浴蒸發(fā)揮去溶劑，樣品研磨粉碎過200目篩后裝填中壓硅膠柱，先用乙酸乙酯洗脫，硅膠柱洗脫通透，再以乙酸乙酯∶丙酮（2∶1）洗脫，每500毫升洗脫液收集為1個流份，流份14～19個中出現(xiàn)沉底物，合并流份，濾取沉淀，濾液靜置，析晶后再濾出沉淀，合并沉淀在甲醇中重結(jié)晶，過濾，得無色針狀結(jié)晶。

1.2.8 蟲草素的純度檢查稱取1.2.7.2項中蟲草素晶體1 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇溶解后并定容至刻度，進(jìn)行HPLC檢查，重復(fù)進(jìn)樣6次，采用面積歸一化法計算分離出蟲草素的純度。

1.2.9 蟲草素的結(jié)構(gòu)鑒定取1.2.7.2項中蟲草素晶體，氘代氯仿溶解后進(jìn)行NMR鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)檢測結(jié)果運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素大孔吸附樹脂吸附條件的考察

2.1.1 大孔樹脂型號的篩選不同型號的大孔吸附樹脂對蟲草素的吸附效果有較大差異，7種樹脂中，HPDD吸附能力最佳，見圖1。

圖1 不同型號樹脂對蟲草素的靜態(tài)吸附量考察

2.1.2 大孔樹脂吸附量的考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)上樣約2.2BV時，大孔樹脂對蟲草素吸附飽和，試驗確定大孔樹脂對蟲草提取液（0.1 mg/mL）的吸附量為2BV。

2.1.3 大孔吸附樹脂洗脫劑濃度的考察結(jié)果顯示，5%乙醇不能洗脫蟲草素，10%乙醇可以洗脫部分蟲草素，20%乙醇可將蟲草素洗脫完全。

2.1.4 蟲草素大孔樹脂洗脫體積的考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20%乙醇洗脫3BV可將蟲草素洗脫完全。

2.2 蟲草素的純度檢查蟲草素的純度檢查HPLC結(jié)果見圖2。檢測純度約為（93.6）%，RSD為0.90%，見表1。

圖2 蟲草素純度檢查HPLC圖

表1 制備蟲草素的純度檢查

2．3蟲草素的結(jié)構(gòu)鑒定取1.2.7.2項中蟲草素晶體，氘代氯仿溶解后進(jìn)行NMR鑒定，結(jié)果如下。

1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：8.15（1H，s，H-2），8.35（1H，s，H-8），5.87（1H，d，H-1′），4.37（1H，m，H-2′），2.24（1H，ddd，Ha-3′），1.92（1H，ddd，Hb-3′），4.34（1H，m，H-4′），3.67（1H，ddd，Ha-5′），3.53（1H，ddd，Hb-5′），5.65（1H，d，2′-OH），5.13（1H，t5′-OH），7.27（2H，br s，N6H2）。

13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：152.5（C-2），148.4（C-4），119.2（C-5），156.1（C-6），139.2（C-8），90.9（C-1′），74.7（C-2′），34.1（C-3′），80.8（C-4′），62.7（C-5′）。

以上數(shù)據(jù)經(jīng)文獻(xiàn)研究，與報道的蟲草素NMR數(shù)據(jù)一致，確認(rèn)化合物為蟲草素，見圖3、4。

圖3 蟲草素的1H-NMR情況

圖4 蟲草素的13C-NMR情況

3 討論

通過多次單因素試驗考察，首先從7種大孔吸附樹脂中，選出HPD-D對蟲草素的吸附效果最佳，通過多次的單因素考察，發(fā)現(xiàn)HPD-D樹脂對蟲草素的吸附飽和量為每克樹脂可吸附2 mL的0.1 g/mL蟲草提取液，洗脫劑為20%的乙醇洗脫3BV可將蟲草素洗脫完全。通過薄層色譜法篩選出硅膠柱色譜洗脫劑為乙酸乙酯∶丙酮（2∶1），洗脫出的蟲草素在甲醇中進(jìn)行重結(jié)晶，純度約為93.6%。

總之，利用大孔樹脂對蟲草素先進(jìn)行吸附富集，去除了人工蛹蟲草中的較多雜質(zhì)，連用硅膠柱色譜進(jìn)行蟲草素的分離簡單便捷，此工藝方法為蟲草素的生產(chǎn)提供了指導(dǎo)意義。

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Macroporous resin combined silicagel column in preparation of cordycepin in the made-up cordyceps militaris

Zhang Lili1，Liang Guoqiang2，Chen Wei2
（1.Outpatient Dispensary of Department of Pharmacy，Suzhou Municipal Hospital，Jiangsu215000，China；2.School of Wu Medicine，Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicince，Jiangsu 215000，China）

Objective To optimize a simple and fast technique of separating and preparing cordycepin from made-up cordyceps militaris.Methods It was studied 7 kinds of different polar macroporous resins to select the best adsorbent resins，as well as the adsorbent quantity，eluent concentrations，elution volumes.Finally，the proportion of silicagel column elution and so on were surveyed and then optimize the best silicagel column elution.Results According to the survey data in the study，the best technique was HPD-D macroporous resin，the adsorbing capacity of resin to cordyceps extraction（0.1 mg/mL）was 2 times resin bed volumn（2BV）with 20%ethyl alcohol.The cordycepin was completely eluted with 3BV eluant.The silicagel column eluent was ethyl acetate vs acetone（2∶1），obtained about 93.60%of the cordycepin crystalline purity by separation.Conclusion The gathered separating tequnique of cordycepin from made-up cordyceps militaris is simple and convenient，which is suitable for large-scale cordycepin production and preparation.is a quick and simple technique to prepare cordycepin.

Cordycepin/analysis；Cordyceps sinensis/chemistry；Chromatography，high pressure liquid；Resins，synthetic

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.009

A

1009-5519（2015）03-0343-03

2014-07-01

2014-10-01）

張莉莉（1976-），女，江蘇蘇州人，主管中藥師，主要從事中藥學(xué)藥劑方面工作；E-mail：144361866@qq.com。

陳偉（E-mail：sztcmcw@sina.com）。