氙氣延遲后處理誘導(dǎo)蛋白激酶B信號通路活化對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

劉詩瑤，侯思雨，楊彥偉，汪曉南，金沐，董秀華，盧家凱，程衛(wèi)平

氙氣延遲后處理誘導(dǎo)蛋白激酶B信號通路活化對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用

劉詩瑤，侯思雨，楊彥偉，汪曉南，金沐，董秀華，盧家凱，程衛(wèi)平

目的：探討蛋白激酶B（Akt）信號通路在氙氣延遲后處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的作用。

方法：建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型。采用隨機數(shù)表法將實驗動物分為7組（n=16）：脊髓缺血再灌注組（I/R組）、脊髓缺血再灌注+氙氣延遲后處理組（I/R+Xe組）、脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑組（I/R+wortmannin組）、脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑二甲基亞砜（DMSO）組（I/R+DSMO組）、脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑+氙氣延遲后處理組（I/R +wortmannin+Xe組）、脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑DMSO+氙氣延遲后處理組（I/R+DMSO+Xe組）、假手術(shù)組（Sham組）。分別于缺血再灌注后6、12、24、48 h觀察記錄大鼠后肢運動功能，于缺血再灌注后4 h（n=8）和48 h（n=8）行尼氏染色、TUNEL染色檢測存活及凋亡指數(shù)，行蛋白印跡法（Western blot） 測定脊髓組織中p-Akt蛋白表達。

結(jié)果：與Sham組相比，其余各組大鼠在各檢測時點后肢運動功能評分顯著降低，脊髓前角運動神經(jīng)元存活數(shù)量顯著減少、凋亡數(shù)量顯著增加，p-Akt水平顯著增高（P＜0.05）。I/R+Xe組較I/R組大鼠在各檢測時點后肢運動功能評分顯著增加，脊髓前角運動神經(jīng)元存活數(shù)量顯著提高、凋亡數(shù)量顯著減少，p-Akt水平顯著增高（P＜0.05）。I/R+wortmannin+Xe組較I/R+Xe組大鼠在各檢測時點后肢運動功能評分明顯下降，脊髓前角運動神經(jīng)元存活數(shù)量顯著減少、凋亡數(shù)量顯著增加，p-Akt水平顯著降低（P＜0.05）。

結(jié)論：氙氣延遲后處理通過激活A(yù)kt信號通路對大鼠脊髓缺血再灌注損傷起到保護作用。

氙氣；延遲后處理；脊髓；缺血再灌注；蛋白激酶B通路

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:498.)

隨著高血壓和動脈粥樣硬化發(fā)病率的增加，主動脈夾層動脈瘤的發(fā)病率隨之增加[1]。外科手術(shù)是其主要治療方法，而術(shù)后截癱發(fā)病率高達10%，術(shù)中脊髓缺血再灌注損傷是導(dǎo)致術(shù)后截癱的重要原因[2]。缺血或藥物后處理對脊髓缺血再灌注損傷具有保護作用[3]。氙氣作為一種惰性麻醉氣體，對心臟、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟的缺血性損傷有保護效應(yīng)[4]。氙氣延遲后處理對脊髓缺血再灌注損傷具有明確保護作用，而保護機制尚不明確[5]。蛋白激酶B（Akt）是肌醇與磷脂酰肌醇（PI）的重要激酶，Akt信號通路激活參與缺血預(yù)處理和后處理對臟器缺血再灌注損傷的保護作用[6]。本研究通過建立大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型，觀察Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與氙氣延遲后處理對脊髓缺血再灌注損傷保護作用，以初步闡明其保護機制。

1 材料和方法

實驗材料：112只8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（SPF級，封閉群），北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重250～350g。

大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型建立[7]：3%戊巴比妥鈉腹腔注射，經(jīng)口氣管插管，全程呼吸機控制呼吸。術(shù)中維持體溫并行肛溫監(jiān)測。經(jīng)左頸總動脈監(jiān)測近端血壓，尾動脈監(jiān)測遠(yuǎn)端血壓。全程記錄近端、遠(yuǎn)端血壓和肛溫。經(jīng)左髂總動脈，將2F球囊導(dǎo)管置入約10 cm，使前端達左鎖骨下動脈開口下3～4 mm水平。經(jīng)尾動脈注射500 U/kg肝素鈉，2 min后充起球囊，完全阻斷左鎖骨下動脈遠(yuǎn)端血流，使遠(yuǎn)端血壓急速下降并持續(xù)低于7 mmHg，通過體位調(diào)整維持近端血壓。25 min后，抽空球囊恢復(fù)水平體位。經(jīng)尾動脈注入魚精蛋白（1 mg魚精蛋白中和100 U肝素鈉）。縫合髂總動脈穿刺處，確保血流通暢。于阻斷前10 min和阻斷后15 min經(jīng)尾動脈行動脈血氣分析。

實驗動物分組和處理方案：將112只大鼠采用隨機數(shù)表法分為7組，每組16只：（1）脊髓缺血再灌注組（I/R組）；（2）脊髓缺血再灌注+氙氣延遲后處理組（I/R+Xe組）；（3）脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑渥曼青霉素（wortmannin）組（I/R+wortmannin組）；（4）脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑二甲基亞砜（DMSO）組（I/R+DSMO組）；（5）脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑wortmannin+氙氣延遲后處理組（I/ R+wortmannin+Xe組）；（6）脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑DMSO+氙氣延遲后處理組（I/R+DMSO+Xe組）；（7）假手術(shù)組（Sham組）（Sham組與I/R組接受相同的手術(shù)過程，但不充起球囊，將穿刺后25 min作為擬再灌注開始時間）。再灌注后30 min，DMSO各組大鼠經(jīng)尾動脈注入濃度5%的DMSO（0.3 ml）；wortmannin各組注入wortmannin（DMSO終濃度5%，0.6 ml/kg,總?cè)莘e0.3 ml）；其余各組注入生理鹽水（0.3 ml）。再灌注后1 h，氙氣延遲后處理各組大鼠經(jīng)呼吸機吸入50%氙氣+50%氧氣混合氣1 h；其余各組吸入50%氮氣+50%氧氣混合氣1 h。模型成功建立標(biāo)準(zhǔn)：再灌注后4 h大鼠存活，且出現(xiàn)后肢運動功能不全（后肢運動功能評分＜21分）。

標(biāo)本取材：每組16只大鼠隨機于再灌注后4 h和48 h經(jīng)深麻醉處死，每時間點8只。將大鼠深麻醉后，開胸經(jīng)左心室灌注200 ml冰鹽水至灌洗液清亮，迅速取出脊髓，脊髓L3～L4節(jié)段置于4℃4%的多聚甲醛中固定，備行石蠟包埋切片（4 μm），進行尼氏及TUNEL染色使用，脊髓L4～L5節(jié)段放置于-80℃液氮中貯存，進行蛋白印跡法（Westernblot） 檢測。

后肢運動功能評分：采用盲法于再灌注后6、12、24和48 h分別對實驗動物進行后肢運動功能評分并錄像，使用BBB（Basso, Beattie and Bresnahan）后肢運動功能評分表[8]。BBB評分從0分（神經(jīng)功能完全缺失）到21分（神經(jīng)功能正常）。

尼氏染色和神經(jīng)元細(xì)胞計數(shù)：采用盲法在400倍光鏡下觀察并記錄尼氏染色切片，每個脊髓節(jié)段隨機抽取3張切片，取3張切片平均值，計數(shù)正常神經(jīng)元。每組8只大鼠。

脊髓組織TUNEL染色：采用盲法在400倍光鏡下觀察記錄TUNEL染色切片，每個脊髓節(jié)段隨機抽取3張切片，取3張切片平均值，計數(shù)正常神經(jīng)元。每組8只大鼠。采用TUNEL檢測試劑盒（ZK-8005，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）測定神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。凋亡神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色細(xì)胞核中有深染棕褐色顆粒。

p-Akt蛋白印跡法檢測：脊髓組織勻漿用蛋白定量試劑盒（BCA法）行蛋白定量并調(diào)整待測樣本的蛋白濃度，配制分離膠（12%），濃縮膠（5%），精確完成蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和抗原封閉。使用3% BSA-TBST稀釋一抗（p-Akt，1:2 000），孵育，洗膜。5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗[山羊抗兔lgG（H+L）HRP，1:20 000]，室溫輕搖40 min，洗膜。X光膠片曝光顯影、定影。分別檢測再灌注后4 h和48 h時點脊髓組織中p-Akt表達水平。

2 結(jié)果

生理參數(shù)（表1）:阻斷前、阻斷后5 min、再灌注后15 min各組大鼠肛溫、近端血壓、阻斷前和再灌注后15 min遠(yuǎn)端血壓行組內(nèi)、組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠遠(yuǎn)端血壓在阻斷后5 min進行組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），各組（Sham組除外）大鼠阻斷后5 min遠(yuǎn)端血壓與同組阻斷前遠(yuǎn)端血壓比較顯著降低, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。表2顯示:各組阻斷前10 min、再灌注后15 min所測血氣分析結(jié)果行組內(nèi)、組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 實驗過程中的生理參數(shù)

表1 實驗過程中的生理參數(shù)

注： I/R組：脊髓缺血再灌注組；I/R+Xe組：脊髓缺血再灌注+氙氣延遲后處理組；I/R+wortmannin組：脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑渥曼青霉素組；I/ R+DSMO組：脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑二甲基亞砜（DMSO）組；I/R+wortmannin+Xe組：脊髓缺血再灌注+PI3K/Akt阻斷劑wortmannin+氙氣延遲后處理組；I/R+DMSO+Xe組：脊髓缺血再灌注+阻斷劑溶劑DMSO+氙氣延遲后處理組；Sham組：假手術(shù)組。與阻斷前血壓比較*P＜0.05 。1 mmHg=0.133 kPa

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表2 阻斷前和再灌注后動脈血氣分析結(jié)果

表2 阻斷前和再灌注后動脈血氣分析結(jié)果

注：pH：酸堿度 PaO2：氧分壓 PaCO2：二氧化碳分壓。余注見表1

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后肢運動功能評分（表3）:Sham組大鼠后肢運動功能評分（21.0±0.2）分。其余各組大鼠在麻醉恢復(fù)后6、12、24、48 h后肢運動功能評分顯著降低，與Sham組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與I/R組大鼠相比，I/R+Xe組和I/ R+DMSO+Xe組后肢運動功能評分在各個時間點均顯著提高，I/R+wortmannin組和I/R+wortmannin+Xe 組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與I/R+Xe組大鼠相比，I/R組、 I/R+wortmannin組、I/R+wortmannin+Xe組及I/R+DMSO組后肢運動功能評分在各個時間點均顯著降低（P＜0.05）。

脊髓組織學(xué)改變、脊髓細(xì)胞凋亡計數(shù)、脊髓組織中p-Akt蛋白印跡法檢測（表4）： Sham組4 h和48 h脊髓組織可見大量正常神經(jīng)元，其余各組脊髓組織中正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少、凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著增加、p-Akt水平顯著增高，與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與I/R組相比，I/R+Xe組和I/R+DMSO+Xe組的4 h和48 h脊髓組織正常神經(jīng)元數(shù)量顯著增多、凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著減少、p-A k t水平

表3 后肢運動功能評分結(jié)果

表3 后肢運動功能評分結(jié)果

注：與Sham組比較*P＜0.05；與I/R組比較△P＜0.05；與I/R+Xe組比較▲P＜0.05。余注見表1

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顯著增高；I/R+wortm annin組和I/R+wortmannin+Xe組的4 h和48 h脊髓組織正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少、凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著增加、p-Akt水平顯著降低（P＜0.05）。與I/R+Xe組相比，I/R組、I/R+wortmannin組、I/R+wortmannin+Xe組和I/R+DMSO組4 h和48 h脊髓組織切片中正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少、凋亡神經(jīng)元數(shù)量顯著增加、p-Akt水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量、脊髓前角運動神經(jīng)元凋亡數(shù)量、蛋白免疫印跡法脊髓組織p-Akt定量

表4 脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量、脊髓前角運動神經(jīng)元凋亡數(shù)量、蛋白免疫印跡法脊髓組織p-Akt定量

注：Akt：蛋白激酶B。與Sham組比較*P＜0.05；與I/R組比較△P＜0.05；與I/R+Xe組比較▲P＜0.05。余注見表1

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3 討論

研究證實，再灌注后1 h吸入50%氙氣+50%氧氣混合氣體，對脊髓缺血再灌注損傷發(fā)揮最大保護作用[5]。大鼠脊髓缺血再灌注后4 h p-Akt達到表達高峰，12 h降至低谷；神經(jīng)元再灌注后4 h出現(xiàn)凋亡，48 h凋數(shù)量最多[9]。因此，選擇再灌注后4 h和48 h進行正常神經(jīng)元、凋亡神經(jīng)元計數(shù)及蛋白定量分析。正常的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中富含尼氏體，而受損的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中尼氏體數(shù)量下降，染色質(zhì)深染，細(xì)胞核固縮。凋亡的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色呈棕褐色。結(jié)果顯示，氙氣延遲后處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷有保護作用，BBB后肢運動功能評分顯著增高，神經(jīng)元存活數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡顯著減少，Akt信號通路被激活，p-Akt表達增加，加入Akt通道阻斷劑wortmannin后這一保護作用被抑制。在實驗過程中因?qū)嶒灄l件限制，標(biāo)本無法在取材同時完成檢測，可能導(dǎo)致結(jié)果顯著性降低。

研究表明，氙氣可以減少缺血再灌注損傷模型中神經(jīng)元的死亡，改善神經(jīng)認(rèn)知和神經(jīng)功能障礙[4]。Fries 等[10]用豬心肺復(fù)蘇模型證實，70%氙氣于再灌注1 h行延遲后處理具有神經(jīng)保護效應(yīng)。Campos-Pires等[11]證實，氙氣對休克腦缺血模型發(fā)揮延遲后處理保護作用的時間窗長達3 h。氙氣的神經(jīng)保護作用機制被認(rèn)為與直接抑制N，N-二甲基亞硝胺受體（NMDA site）介導(dǎo)的興奮毒性、興奮細(xì)胞膜雙孔鉀通道及細(xì)胞膜三磷酸腺苷敏感鉀通道等有關(guān)[4]。但氙氣延遲后處理發(fā)揮脊髓缺血再灌注損傷保護作用的機制仍有待研究。

Bcl-2/Bax被認(rèn)為是PI3K-Akt的下游效應(yīng)因子。研究證實，氙氣通過調(diào)節(jié)Bcl-2/bax的表達發(fā)揮延遲后處理對大鼠脊髓缺血再灌注的保護作用[5]。PI3K-Akt 信號通路參與調(diào)控多種影響細(xì)胞生存的轉(zhuǎn)錄因子，如環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB） 和核因子（NF）-κB和Forkhead 1等。CREB和NF-κB 的激活可增強抗凋亡基因Bcl-2 的表達。同時，PI3K-Akt可抑制促凋亡基因Bad 的表達。有研究指出，在全腦和局部腦缺血再灌注后均有暫時的Akt磷酸化的增強[12]。還有研究證實，局部腦缺血再灌注損傷模型缺血后處理可通過激活PI3K-Akt 信號通路產(chǎn)生長時程腦保護效應(yīng)[13]。目前，仍很少有研究觀察和分析氙氣的神經(jīng)保護作用與PI3K-Akt通路的關(guān)系。本研究結(jié)果證實，氙氣延遲后處理對大鼠脊髓缺血再灌注的保護作用是通過PI3K-Akt通路發(fā)生作用的。

細(xì)胞凋亡的機制涉及多個方面，如線粒體膜通透性及鈣離子水平等[14]。有研究表明，藥物預(yù)處理及后處理均通過線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔（mPTP）發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[15]。另一項研究指出，氙氣預(yù)處理可以通過激活促存活信號（p-Akt）從而促進線粒體的存活[16]。在心肌缺血再灌注損傷后處理模型中，p-Akt 在mPTP 處高表達[17]。氙氣延遲后處理激活A(yù)kt 信號通路是否通過進一步抑制mPTP 活性發(fā)揮保護作用仍有待進一步研究證實。

綜上所述，氙氣延遲后處理可以通過誘導(dǎo)Akt通路活化產(chǎn)生大鼠脊髓缺血再灌注損傷保護作用。

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The Protective Roll of Xenon Delayed Post-conditioning Via AKT Signal Pathway Activation in Spinal Cord Ischemia/Reperfusion Injury in Rats

LIU Shi-yao, HOU Si-yu, YANG Yan-wei, WANG Xiao-nan, JING-mu, DONG Xiu-hua, LU Jia-kai, CHENG Wei-ping.
Department of Anesthesiology, Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing (100029), China

Objective: Spinal cord ischemia/reperfusion (I/R) injury may lead spinal cord functional impairment and paraplegia, and we want to investigate the protective roll of xenon (Xe) delayed post-conditioning via protein kinase B (Akt) signal pathway activation in spinal cord I/R injury in experimental rats.Methods: A total of 112 male SD rats were divided into 7 groups: ①I/R group,②I/R+Xe group,③I/R+wortmannin (PI3K-Akt blocker) group,④I/R+DMSO (solvent) group,⑤I/R+wortmannin+Xe group,⑥I/R+DMSO+Xe group,⑦Sham group. n=16 in each group. The excise function in hind legs of rats were observed at 6, 12, 24, 48 hours after treatment; the survival neuron was examined by Nissl staining and TUNEL staining at 4, 48 hours after treatment, and the protein expression of p-Akt in spinal cord was measured by Western blot analysis.Results: Compared with Sham group, all other groups showed obviously decreased excise function in hind legsof rats with less spinal motor neurons, more apoptosis and lower protein expression of p-Akt at each time point, P＜0.05. Compared with I/R group, I/R+Xe group presented increased excise function in hind legs, more spinal motor neurons, less apoptosis and elevated protein expression of p-Akt P＜0.05. Compared with I/R+Xe group, I/R+wortmannin+Xe group indicated decreased excise function in hind legs, less spinal motor neurons, more apoptosis and inhibited protein expression of p-Akt, P＜0.05. While protein expression level was similar between I/R group and I/R+wortmannin+Xe group, P＞0.05.Conclusion: Xenon delayed post conditioning may protect spinal cord I/R injury via Akt pathway activation in experimental rats.

Xenon; Delayed post-conditioning; Spinal cord; Ischemia reperfusion injury; AKT signal pathway

2015-02-12）

（編輯：汪碧蓉）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81070975）；衛(wèi)生部行業(yè)專項基金（201402009）

100029 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 麻醉科

劉詩瑤 碩士研究生 研究方向：心血管麻醉及圍術(shù)期臟器功能保護 Email：shiyao312@sina.com 通訊作者：程衛(wèi)平

Email：ch_eng9735 @sina.com

R54

A

1000-3614（ 2015 ）05-0498-05

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.05.020