鐵過量對大鼠淋巴細胞DNA損傷的影響

何麗敏，孫永葉，蔡 靜，張華琦，王亞錦，馬愛國*

（青島大學醫(yī)學院醫(yī)學營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021）

鐵過量對大鼠淋巴細胞DNA損傷的影響

何麗敏，孫永葉，蔡 靜，張華琦，王亞錦，馬愛國*

（青島大學醫(yī)學院醫(yī)學營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021）

鐵是人體必需的微量元素之一，有重要的生物學功能。據(jù)世界衛(wèi)生組織2007年報道，世界范圍內(nèi)有10%～30%的人存在不同水平缺鐵性貧血［1］，這一疾病嚴重影響身體狀況、工作效率以及身心健康發(fā)展［2］。隨著人們補鐵意識的增強，膳食鐵攝入增多，各種鐵補充劑的使用也日漸增多，但由于機體排鐵能力相對不足，過多的鐵補充使鐵過載更容易發(fā)生。2005年美國一項人群鐵過載篩查及與遺傳性血色病及慢性疾病關(guān)系的調(diào)查研究顯示，美國居民鐵過載（鐵蛋白水平男性＞600 μg/L，女性＞500 μg/L）的總檢出率為2.82%［3］。

研究表明，體內(nèi)過量的鐵沉積可導(dǎo)致自由鐵的增多進而通過催化Fenton反應(yīng)生成羥自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織細胞的氧化損傷，損害機體脂質(zhì)、蛋白等［4-5］，從而引起骨質(zhì)疏松、肝硬化、糖尿病、心血管疾病等各種疾?。?］。DNA作為生物體最重要的遺傳物質(zhì)，在機體整個生命活動過程中起著重要作用，而DNA損傷能夠加速細胞的衰老和凋亡、引起癌癥和腫瘤等疾病。Sara等［6］研究認為，鐵儲存的增多可能是DNA氧化損傷以及骨吸收的危險因素，而目前鐵補充過量或鐵過載是否對機體細胞DNA造成嚴重損傷的確切研究較少，本研究以大鼠為研究對象，通過采用腹腔注射不同劑量右旋糖酐鐵，擬探討了不同劑量鐵對大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

右旋糖酐鐵注射液，購自浙江瑞安市制藥廠，批準文號為國藥準字H33021758；RMPI-1640培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；胎牛血清和淋巴細胞分離液，均購自天津灝洋生物；正常熔點瓊脂糖、低溶點瓊脂糖和Triton X-100，均購自北京索萊寶公司；熒光劑DAPI（4′，6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride）， 購自Boehringer Mannheim 公司；血清鐵試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、HCl和NaOH均為國產(chǎn)AR級試劑；低溫離心機，購自美國Sigma公司，30-30K型；低溫冰箱；DYY-60型電泳儀，購自北京六一儀器廠；熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司；722s分光光度計，購自上海精密儀器科學有限公司。

1.2 動物分組與飼養(yǎng)

SPF級雄性Wistar大鼠40只，6～7周齡，體質(zhì)量（160±20） g，購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社，生產(chǎn)合格證號SCXK（魯）20130001。大鼠于實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)隨機數(shù)字表法按體質(zhì)量分為4組，每組10只：對照組、缺鐵組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組，隔日分別腹腔注射濃度為1.25、0.45、12.50和25 mg/mL的右旋糖酐鐵0.72 mL，每組分別含F(xiàn)e2+0.9、0.3、9和18 mg，連續(xù)干預(yù)6周后采血進行檢測。

實驗期間大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，動物房溫度22～24℃，濕度50%～60%。大鼠喂飼按照AIN-93G配方制備的基礎(chǔ)無鐵飼料［3］，自由進食，飲用去離子水。1.3測定指標和方法

1.3.1 血樣采集 第6周末，大鼠禁食8 h，眼眶取血3mL，0.5%的肝素鈉抗凝，立即混勻，取100 μL全血用于DNA損傷分析。其余全血經(jīng)3 000 r/min離心10min，收集上層血清測定血清鐵，剩余血清儲存于-20℃冰箱中備用。

1.3.2 血清鐵測定 采用血清鐵測定試劑盒測定大鼠血清中鐵含量。在酸性溶液和還原劑的作用下，運鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中的高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)，鐵離子的多少與色澤成正比，使用分光光度計測定吸光度D（540）值，按下式計算血清鐵濃度。

血清鐵濃度（μ m o l/L）=｛［（測定管D（540）值-空白管D（540）值）］/［（標準管D（540）值-空白管D（540）值）］｝×標準濃度（35.81 μmol/L）

1.3.3 淋巴細胞DNA氧化損傷檢測 采用堿性單細胞凝膠電泳法（SCGE）［8］檢測大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷，本底損傷在提取大鼠外周血淋巴細胞后，直接進行鋪膠-裂解-電泳-中和-染色等步驟進行SCGE分析；而使用H2O2聯(lián)合本底損傷時，取同一只大鼠的外周血淋巴細胞，給予10 μmol/L的H2O2，在冰上放置5min，離心收集細胞后進行SCGE分析?！板缧恰眻D像采用半定量分析，一個典型“彗星”圖象包括頭部和尾部，不同程度損傷根據(jù)可見熒光的尾部與其可見頭部的比例大小而分為0、l、2、3、4共5個等級。實驗分析時，每個血樣觀察100個“彗星”細胞［8］。

本研究使用的DNA損傷水平的單位（arbitray units，AU）［9］是一種根據(jù)頭部大小、尾長及其熒光強度衡量DNA鏈斷裂損傷程度的特有單位，把不同的分級加以換算統(tǒng)計，便得到DNA損傷的總體水平（DNA損傷=0級細胞數(shù)×0+1級細胞數(shù)×1+2級細胞數(shù)×2+3級細胞數(shù)×3+4級細胞數(shù)×4）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，血清鐵、DNA損傷率結(jié)果以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD方法。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠血清鐵的含量

實驗結(jié)束時，各組大鼠血清鐵的含量存在顯著差異（P＜0.01）。缺鐵組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組與對照組相比，缺鐵組血清鐵顯著降低（P＜0.01），而10倍及20倍鐵劑量補充組血清鐵顯著升高（P＜0.01）；20倍鐵劑量補充組與10倍鐵劑量補充組比較，20倍鐵劑量補充組血清鐵顯著升高（P＜ 0.01）。結(jié)果見表1。

表1 腹腔注射不同劑量右旋糖酐鐵后大鼠血清鐵含量（±s，n=10）

與對照組比較，*P＜0.01；與缺鐵組比較，#P＜0.01；與10倍鐵劑量補充組比較，&P＜0.01.

組別血清鐵（μ m o l / L）對照組7 7 . 6 2± 10. 8 4缺鐵組53. 54± 10. 9 7 * 10倍鐵劑量補充組104. 7 7 ± 8 . 9 1* # 20倍鐵劑量補充組205. 3± 7 . 52* # &

2.2 鐵過量對淋巴細胞DNA的氧化損傷

過量補充鐵后，各組大鼠均存在不同程度的DNA損傷（圖1、表2）。對照組、缺鐵組、10倍和20倍鐵劑量補充組大鼠外周血淋巴細胞的DNA損傷率分別為16.9%、17.6%、59.7%和84.6%，與對照組相比，缺鐵組DNA損傷總體水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.715），10倍和20倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平均顯著升高（P＜0.01）；10倍鐵劑量補充組與缺鐵組比較，10倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平顯著升高（P＜0.01）；20倍鐵劑量補充組與10倍鐵劑量補充組比較，20倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 腹腔注射不同劑量右旋糖酐鐵后大鼠淋巴細胞DNA損傷總體水平（AU，±s）

與對照組比較，*P＜0.01；與缺鐵組比較，#P＜0.01；與10倍鐵劑量補充組比較，&P＜0.01.

組別D N A損傷分級0級1級2級3級4級本底損傷對照組8 3. 13± 5. 7 414. 13± 3. 8 31. 7 5± 1. 39 0. 50± 0. 7 6 0. 50± 1. 4121. 13± 10. 43缺鐵組8 2. 40± 2. 8 412. 8 0± 5. 052. 7 0± 2. 9 8 1. 30± 1. 8 30. 8 0± 1. 48 25. 30± 9 . 0210倍鐵劑量補充組40. 30± 14. 2546 . 40± 14. 105. 7 0± 2. 7 15. 40± 2. 8 8 2. 20± 2. 048 2. 8 0± 19 . 26 * # 20倍鐵劑量補充組15. 38 ± 10. 08 38 . 8 8 ± 18 . 5019 . 38 ± 5. 6 013. 6 3± 6 . 48 12. 7 5± 11. 8 516 9 . 50± 43. 8 1* # &

2.3 H2O2對各組鐵過量大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的影響

以10 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)的對照組、缺鐵組、10倍和20倍鐵劑量補充組大鼠外周血淋巴細胞的DNA損傷率分別為89.5%、91.5%、96.6%和100% （圖2、表3），顯著高于各組大鼠本底DNA損傷率（P＜ 0.01）；缺鐵組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組與對照組相比，缺鐵組DNA損傷總體水平無明顯差異（P= 0.804），10倍和20倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平均顯著升高（P＜0.01）；10倍鐵劑量補充組與缺鐵組比較，10倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平顯著升高（P＜0.01）；20倍鐵劑量補充組與10倍鐵劑量補充組比較，20倍鐵劑量補充組DNA損傷總體水平升高（P＜0.05）。

表3 10 μmol/L H O對腹腔注射不同劑量右旋糖酐鐵后大鼠淋巴細胞DNA損傷總體水平的影響（AU，±s）22

與對照組比較，*P＜0.01；與缺鐵組比較，#P＜0.01；與10倍鐵劑量補充組比較，&P＜0.05.

組別D N A損傷分級0級1級2級3級4級10 μ m o l / L H O聯(lián)合本底損傷22對照組10. 50± 1. 7 7 17 . 00± 3. 3012. 7 5± 3. 1522. 50± 2. 6 237 . 25± 5. 8 5259 . 00± 15. 14缺鐵組3. 7 0± 2. 7 9 17 . 30± 3. 4012. 6 0± 4. 0324. 10± 3. 7 6 42. 30± 5. 2526 0. 40± 4. 6 210倍鐵劑量補充組3. 40± 2. 6 313. 6 0± 5. 4012. 10± 4. 1527 . 6 0± 13. 9 243. 30± 12. 7 529 3. 8 0± 14. 20* # 20倍鐵劑量補充組012. 38 ± 1. 6 9 16 . 6 3± 2. 5020. 7 5± 4. 8 050. 25± 7 . 23308 . 8 8 ± 10. 8 9 * # &

2.4 H2O2與鐵過量對大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷的劑量反應(yīng)關(guān)系

大鼠淋巴細胞本底損傷及10 μmol/L H2O2聯(lián)合本底損傷與鐵補充劑量的劑量反應(yīng)關(guān)系見圖3。在對照組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組中，DNA本底損傷水平隨著鐵劑量的升高而增加，10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷水平分別為對照組的3.9倍、8.0倍；經(jīng)10μmol/L H2O2誘導(dǎo)后，大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷水平較本底損傷水平明顯升高，且DNA損傷水平在對照組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組中隨著鐵劑量的增加而增加，10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷分別為對照組的1.1倍、1.2倍。

3 討 論

右旋糖酐鐵為可溶性鐵，常用作臨床治療貧血患者的注射用鐵劑［10］，本研究根據(jù)實驗動物與人之間的劑量“等效”換算常用原則［11］，以分別給予Wistar大鼠腹腔注射不同劑量的右旋糖酐鐵（鐵含量0.3、0.9、9、18 mg的給藥濃度）來模擬人體中各種鐵劑量的情況。血清鐵是評價鐵負荷的特異性指標［12］，本研究結(jié)果顯示缺鐵組大鼠血清鐵含量顯著低于對照組，10倍與20倍鐵劑量補充組均顯著高于對照組，因此大鼠不同劑量鐵負荷模型建立成功。

目前已有研究證實，機體內(nèi)過多的鐵可以通過催化反應(yīng)生成具有高度反應(yīng)活性的羥自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致DNA氧化損傷［13-14］。本研究采用SCGE檢測不同劑量鐵對大鼠外周血淋巴細胞DNA本底損傷的影響，10倍、20倍鐵劑量補充組大鼠淋巴細胞DNA損傷分別為對照組的3.9倍、8.0倍，且對照組、10倍和20倍鐵劑量補充組的DNA損傷率分別為16.9%、59.7%和84.6%，說明10倍、20倍鐵劑量補充能造成大鼠淋巴細胞DNA明顯的損傷，且在鐵補充過量的狀況下隨著鐵劑量的增加大鼠淋巴細胞DNA損傷水平加重，這與既往研究結(jié)果一致［14］。經(jīng)10 μmol/L H2O2誘導(dǎo)后，大鼠外周血淋巴細胞DNA氧化損傷水平較本底損傷水平明顯加重，10倍、20倍鐵劑量補充組大鼠淋巴細胞DNA損傷分別為對照組的1.1倍、1.2倍，且對照組、10倍和20倍鐵劑量補充組的DNA損傷率分別為89.5%、96.6%和100%，表明10 μmol/L H2O2能對大鼠外周血淋巴細胞造成較大損傷，但由于10倍、20倍鐵過量已能對DNA造成較大損傷，當增加H2O2聯(lián)合后機體DNA損傷能達到100%，并不能體現(xiàn)H2O2對鐵過載造成損傷的增加作用。

缺鐵會導(dǎo)致貧血、免疫力低下，缺鐵與癌癥及癌癥并發(fā)癥存在關(guān)聯(lián)，同時缺鐵能影響癌癥治療［15］，缺鐵也能影響大腦形態(tài)學、神經(jīng)化學以及生物能的功能，影響神經(jīng)傳遞和髓鞘形成［16］。目前研究缺鐵導(dǎo)致大鼠DNA損傷的研究較少，Javier等［17］通過每天給予缺鐵組大鼠鐵含量5 mg/kg飼料、對照組鐵含量45 mg/kg飼料來建立大鼠缺鐵性貧血模型，40 d試驗結(jié)束后，結(jié)果顯示缺鐵組大鼠DNA損傷與對照組比較無明顯差別。Javier通過這一結(jié)果認為低鐵造成的氧化損傷較小，機體有足夠的代償能力來防御這一損傷。本研究中，缺鐵組大鼠本底DNA損傷與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，且經(jīng)10 μmol/L H2O2誘導(dǎo)后，缺鐵組DNA損傷較誘導(dǎo)前顯著加重，但與對照組比較仍無顯著差異，此結(jié)果與上述報道基本一致。

綜上所述，鐵補充過量能對大鼠淋巴細胞DNA產(chǎn)生損傷，且隨著補鐵劑量的增加DNA損傷加重，這一結(jié)果為日后的深入研究提供了一定的基礎(chǔ)。本研究中10倍劑量的鐵補充能對大鼠淋巴細胞DNA產(chǎn)生損傷，更低劑量的鐵補充是否能造成損傷還有待于進一步的研究。

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The effects of iron excess on lymphocyte DNA damage in rats

HE Limin，SUN Yongye，CAI Jing，ZHANG Huaqi，WANG Yajin，MA Aiguo*
（Institute of Human Nutrition， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266021， Shandong， China）

目的： 探討不同劑量鐵補充對大鼠淋巴細胞DNA損傷的影響。方法：SPF級6～7周齡雄性Wistar大鼠40只，按體質(zhì)量隨機分為4組，每組10只大鼠，即對照組、缺鐵組、10倍鐵劑量補充組、20倍鐵劑量補充組，4組均采用隔日腹腔注射右旋糖酐鐵，每次注射0.72 mL，每次注射含F(xiàn)e2+分別為0.9、0.3、9和18 mg，連續(xù)注射6周。4組大鼠自由飲用去離子水，喂飼無鐵飼料，于第6周末眼眶取血，使用血清鐵試劑盒測定血清鐵濃度，采用堿性單細胞凝膠電泳法測定大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷狀況。結(jié)果：缺鐵組大鼠血清鐵含量為53.54 μmol/L，明顯低于正常對照組的77.62 μmol/L（P＜0.01），10倍和20倍鐵劑量補充組大鼠血清平均鐵含量分別達到104.77 μmol/L和205.30 μmol/L，顯著高于對照組（P＜0.01）。外周血淋巴細胞DNA本底損傷分析顯示，缺鐵組和正常對照組淋巴細胞DNA損傷總體水平分別為25.30 AU和21.13 AU，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），10倍和20倍鐵劑量補充組DNA自發(fā)損傷水平分別為對照組的3.9倍和8.0倍（82.80 AU和169.50 AU），顯著高于對照組（P＜0.01）；然而H2O2與鐵過量聯(lián)合損傷分析顯示，大鼠外周血淋巴細胞在10 μmol/L H2O2處理后，缺鐵組大鼠DNA氧化損傷水平達到260.40 AU，與對照組（259.00 AU）相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而10倍和20倍鐵劑量補充組分別為對照組的1.1倍和1.2倍（293.80 AU和308.88 AU），均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。結(jié)論：10倍、20倍鐵劑量補充均可提高機體鐵的營養(yǎng)狀況或增加鐵負荷水平；與正常鐵攝入水平相比，鐵缺乏未見DNA本底及H2O2聯(lián)合損傷增加，而鐵補充過量可引發(fā)機體外周血淋巴細胞DNA本底損傷增加及H2O2聯(lián)合損傷加劇。

鐵；DNA損傷；淋巴細胞；彗星電泳；大鼠

OBJECTIVE:To investigate the effects of different doses of iron supplementation on lymphocyte DNA damage in rats.METHODS：Forty male Wistar rats were randomly divided into control group，iron deficiency group，10 times-iron as control group and 20 times-iron as control group， containing Fe2+0.9，0.3，9 and 18 mg，respectively. All rats were treated with intraperitoneal injection of 0.72 mL iron dextran every other day and the entire study lasted for 6 weeks. The rats in the four groups were provided with deionized water and food without iron，both freely available. After 6 weeks，the level of serum iron was determined by spectrophotomety and the peripheral blood lymphocyte DNA damage was assessed using comet assay.RESULTS：The level of serum iron in the iron deficiency group （53.54 μmol/L） was significantly lower than that of control group （77.62 μmol/L）（P＜0.01）. In addition，the levels of serum iron in 10 times-iron （104.77 μmol/L） and 20 times-iron groups （205.30 μmol/L） were significantly higher than that of control group（P＜0.01）. DNA damage assessment indicated that there was no difference between iron deficiency group（25.30 AU） and control group （21.13 AU）（P＞0.05）. However the DNA damage of 10 times-iron group （82.80 AU） and 20times-iron group （169.50 AU） were significantly higher than control group （P＜0.01） ，being 3.9 times and 8.0 times，respectively，as control group. The results of combined DNA damage induced by 10 μmol/L H2O2showed that there was no difference between iron deficiency（260.40 AU） group and control group （259.00 AU） （P＞0.05）. The combined DNA damage of 10 times-iron group （293.80 AU） and 20 times-iron group （308.88 AU） were higher significantly than controlgroup（P＜0.01），which were 1.1 times and 1.2 times，respectively，as control group.CONCLUSION：10 times and 20times iron supplements could improve the iron nutritional status in body or increase the level of iron load. Iron deficiency could not increase the level of usual DNA damage or combined DNA damage，but iron overload could increase the level of lymphocyte DNA damage and c ombined DNA damage.

iron；DNA damage；lymphocyte；comet assay；rats

Q581，R994.4

A

1004-616X（2015）01-0059-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.013

2014-10-21；

2014-12-29

國家自然科學基金（81373000）

作者信息：何麗敏，E-mail：banxia75@163.com。*通信作者，馬愛國，E-mail：m agfood@ 126.com