雙重RT-PCR快速檢測H7N9流感病毒方法的建立

蔣文明，李金平，于美芳，孫文博，王素春，彭 程，侯廣宇，劉 朔，杜 翔，于建敏，陳繼明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100）

雙重RT-PCR快速檢測H7N9流感病毒方法的建立

蔣文明1，李金平1，于美芳1，孫文博2，王素春1，彭 程1，侯廣宇1，劉 朔1，杜 翔1，于建敏1，陳繼明1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100）

為建立簡便快速檢測H7N9亞型流感病毒的方法，根椐GenBank中H7亞型流感病毒的HA基因序列和N9亞型流感病毒的NA基因序列，設(shè)計2對特異性引物，在建立H7亞型和N9亞型單項RT-PCR的基礎(chǔ)上，優(yōu)化雙重RT-PCR反應(yīng)條件，建立同時檢測H7亞型和N9亞型的雙重RT-PCR。對H7N9亞型流感病毒核酸模板進(jìn)行雙重RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可同時擴(kuò)增HA基因263bp、NA基因520 bp的特異性片段，而對其他常見亞型的流感病毒的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗結(jié)果表明，該雙重RT-PCR方法的檢測下限為3 pg的H7N9病毒模板。利用該雙重RT-PCR方法對30份臨床樣品進(jìn)行H7N9病毒進(jìn)行檢測，與病毒分離方法進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，兩者的符合率為100%。結(jié)果表明建立的雙重RT-PCR檢測方法，具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確的特點，可用于H7N9流感病毒的同時檢測和鑒別診斷，為H7N9亞型流感的有效防控提供技術(shù)支撐。

流感病毒；H7N9；雙重RT-PCR

2013年以來，各地陸續(xù)暴發(fā)的H7N9流感，給我國家禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)中國畜牧業(yè)協(xié)會的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，從H7N9暴發(fā)之后的一周之內(nèi)，家禽行業(yè)的損失高達(dá)100億。截至2013年上半年，受H7N9流感疫情影響，在短短3個月的時間內(nèi)，養(yǎng)殖場戶直接經(jīng)濟(jì)損失超過600億元[1]。H7N9還嚴(yán)重威脅著人類的健康，目前有20多個省份發(fā)現(xiàn)了H7N9病例，而且病例數(shù)和死亡數(shù)還在持續(xù)增加。

目前，從家禽和環(huán)境中分離的家禽H7N9流感病毒雖然對家禽無致病力，但存在變異成高致病性毒株的風(fēng)險。為加強(qiáng)源頭控制，及時發(fā)現(xiàn)、逐步剔除H7N9流感病毒，切實保障畜禽產(chǎn)品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部組織實施了《全國家禽H7N9流感剔除計劃》。因此，建立H7N9流感病毒的快速檢測方法十分必要。傳統(tǒng)的檢測方法，包括分步分別鑒定HA亞型和NA亞型，或者采用流感病毒通用HA和NA基因擴(kuò)增后測序的方法，或者熒光定量的方法進(jìn)行檢測。這些方法存在費(fèi)時費(fèi)力或在基層獸醫(yī)實驗室難以操作的缺點。因此，有必要建立一種能應(yīng)用廣泛、高效的檢測方法。本研究建立了一種能同時鑒別H7亞型和N9亞型的雙重RT-PCR方法，并對該方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1.1 病毒

A/chicken/K89/Jiangsu/2013（H7N9）、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等亞型的禽流感病毒均由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

QIAamp Viral RNA Mini Kit購自Qiagen公司，HiScript II One Step RT-PCR Kit購自Vazyme公司，DL2000 DNA Marker購自Takara公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中發(fā)表的序列，針對流感病毒N9序列保守區(qū)設(shè)計一對引物（表1）。擴(kuò)增H7的引物參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NY/T 772-2013）[2]。

表1 擴(kuò)增H7亞型和N9亞型的引物

1.4 病毒RNA提取

根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明提取病毒RNA，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單重RT-PCR擴(kuò)增

用引物對H7F/H7R和N9F/N9R分別進(jìn)行擴(kuò)增。在微量核酸分析以上測定病毒RNA的含量后，將RNA作10倍比稀釋，取3.0μL稀釋后的RNA模板，加入到22.0μL RT-PCR預(yù)混液中，包括12.5μL 2×RT-PCR Buffer，引物各1.0μL（10μmol/L），1.25μL Enzyme Mix，6.25μL ddH2O。RT-PCR反應(yīng)條件為50℃ 30min，94℃ 2min，然后進(jìn)行35個循環(huán)（94℃ 30s，50或54℃ 30s，72℃ 30s），最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 雙重RT-PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

利用上述優(yōu)化的兩對引物建立檢測H7和N9的雙重RT-PCR檢測方法，分別對退火溫度、引物濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

最適退火溫度的確立：分別以50、51、52、53、54、55、56、57℃的退火溫度進(jìn)行梯度RTPCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據(jù)不同退火溫度下目的條帶的亮度確定最適退火溫度。

最適引物濃度的確立：上、下游引物終濃度分別為0.1、0.2、0.4μmol/L，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定最適引物濃度。

1.7 雙重RT-PCR方法的特異性

利用優(yōu)化的雙重RT-PCR方法分別檢測H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等常見亞型的禽流感病毒，檢驗雙重RT-PCR方法的特異性。

1.8 雙重RT-PCR方法的敏感性

在微量核酸分析以上測定H7N9病毒RNA的含量后，作10倍比稀釋，利用優(yōu)化的雙重RTPCR方法對不同稀釋度的RNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗雙重RT-PCR方法的敏感性。

1.9 雙重RT-PCR方法與病毒分離方法的比較

對30份臨床樣品，利用建立的雙重RT-PCR方法與病毒分離的方法進(jìn)行H7N9病毒檢測，檢驗雙重RT-PCR方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 單重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

從含有H7N9流感病毒的尿囊液中擴(kuò)增得到H7亞型和N9亞型特異的基因片段。2.0%的瓊脂糖凝膠電泳證明獲得了與預(yù)期片段大小相符的條帶（圖1）。結(jié)果表明，H7F/H7R引物對的檢測下限為300 fg，N9F/N9R引物對的檢測下限為300 fg，兩對引物均具有較高的檢測效率。

圖1 H7亞型（A）和N9亞型（B）引物對不同濃度H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

2.2 雙重RT-PCR方法的建立及優(yōu)化

通過對H7亞型和H9亞型2對特異性引物濃度及雙重RT-PCR擴(kuò)增溫度等的優(yōu)化，最后確定雙重RT-PCR中最佳引物濃度分別為H7的上、下游引物各0.4 μmol/L、N9的上、下游引物各0.2 μmol/L；最佳退火溫度為50℃（圖2、3）。雙重RT-PCR的最佳反應(yīng)模式為：50℃ 30min，94℃2min，然后進(jìn)行35個循環(huán)（94℃ 30s，50℃ 30s，72℃45 s），最后72℃延伸5min。

2.3 雙重RT-PCR方法的特異性

利用建立的雙重RT-PCR方法分別對H7N9、 H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H9N2等亞型的禽流感病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果該方法只能擴(kuò)增H7亞型和N9亞型的流感病毒，對其它亞型的流感病毒無擴(kuò)增（圖4），結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

圖2 不同引物濃度對H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

圖3 不同退火溫度對H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

圖4 雙重RT-PCR方法對不同亞型流感病毒RNA的擴(kuò)增

2.4 雙重RT-PCR方法的敏感性

測定模板RNA的初始濃度為100 μg/ml。將提取的RNA依次做10倍比稀釋，每個稀釋度取3μL作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示3 pg的H7N9可擴(kuò)增出特異性條帶（圖5），說明該方法具有良好的敏感性。

圖5 雙重RT-PCR對不同濃度H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

2.5 雙重RT-PCR方法與病毒分離方法的比較

30份臨床樣品中，有24份經(jīng)該雙重RT-PCR方法檢測為陽性（圖6）。通過實驗室病毒分離的方法，24份樣品中可以分離到病毒，兩種方法的符合率為100%，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

圖6 雙重RT-PCR方法對臨床樣品H7N9病毒核酸檢測結(jié)果

3 討論

H7N9亞型流感病毒是一種新型的流感病毒，2013年3月上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)[3，4]，之后迅速蔓延，目前已在全國二十多個省市發(fā)現(xiàn)該病毒引起的病例。H7N9流感病毒在引起人感染死亡的同時，給養(yǎng)禽業(yè)造成了沉重打擊。

在進(jìn)行雙重RT-PCR的研究中，引物的設(shè)計至關(guān)重要，要求所設(shè)計的引物GC含量相近，Tm值相近，確保在相同的退火溫度下，不同基因片段都能得到很好的擴(kuò)增。另外，引物特異性要好，盡量避免非特異性擴(kuò)增，干擾結(jié)果判定。雙重PCR反應(yīng)在同一體系內(nèi)進(jìn)行，復(fù)合擴(kuò)增物中的引物之間、模板之間、引物與模板之間可能存在抑制，因此，在試驗過程中必須對各種條件進(jìn)行優(yōu)化。

針對H7N9亞型流感病毒的HA基因和NA基因保守序列，本研究設(shè)計了5套引物，通過分析其特異性和引物之間的二聚體，經(jīng)反復(fù)摸索及優(yōu)化引物濃度和退火溫度，得到最佳的反應(yīng)條件，成功篩選出適合同時檢測H7亞型和N9亞型的雙重RTPCR方法，一管檢測既可確定H7N9亞型流感病毒，也可鑒別單個H7亞型或N9亞型流感病毒，且相互間沒有干擾，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性和特異性。

本研究所建立的雙重RT-PCR的方法，對于H7亞型流感病毒和N9亞型流感病毒的檢測均可出現(xiàn)與試驗設(shè)計大小相符的條帶，而對于其他亞型流感病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表現(xiàn)出較好的特異性；通過敏感性試驗，本方法最低能檢出3 pg的H7N9亞型流感病毒模板，證明該方法的敏感性較高。與病毒分離方法相比，該方法表現(xiàn)出高度的準(zhǔn)確性。

本研究建立的H7N9亞型流感病毒雙重RT-PCR檢測方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡單等優(yōu)點，在同一反應(yīng)體系中，加入2對引物，同時檢測2個目的基因，一管多檢，省時省力。該方法實現(xiàn)了對H7N9亞型流感病毒的快速檢測，同時還可確定H7亞型流感病毒、N9亞型流感病毒，應(yīng)用前景廣闊，對H7N9流感的早期診斷和有效防控具有重要意義。

總之，本研究所建立的雙重RT-PCR對于同時檢測H7亞型和N9亞型流感病毒具有方便快捷、特異性良好、敏感性較高的特點，對H7N9亞型流感病毒的監(jiān)測和防控有重要意義。

[1] 蔣文明. 從“H7N9禽流感”命名說開去[J].中國動物檢疫，2014，8（31）：80-82.

[2] 農(nóng)業(yè)部. NY/T 772-2013禽流感病毒RT-PCR檢測方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014-01-01．

[3] Gao R，Cao B，Hu Y，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. N Engl J Med. 2013;368：1888-1897.

[4] Kageyama T，F(xiàn)ujisaki S，Takashita E，et al. Genetic analysis of novel avian A（H7N9） infl uenza viruses isolated from patients in China，F(xiàn)ebruary to April 2013[J]. Euro Surveill. 2013;18：20453.

Development of a Duplex RT-PCR Method for Rapid Detection of H7N9 Subtype Infl uenza Virus

Jiang Wenming1，Li Jinping1，Yu Meifang1，Sun Wenbo2，Wang Suchun1，Peng Cheng1，Hou Guangyu1，Liu Shuo1，Du Xiang1，Yu Jianmin1，Chen Jiming1
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032； 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100）

To establish a simple and rapid method for detection of H7N9 subtype infl uenza virus，two pairs of specifi c primers were designed according to the conserved regions on the HA sequences of H7 subtype infl uenza virus and the NA sequences of N9 subtype influenza virus in GenBank. A duplex reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR） method was developed for simultaneously detection of H7 subtype and N9 subtype infl uenza virus based on the single RT-PCR for H7 and N9 subtypes and on further optimization of duplex RT-PCR conditions. Amplifi cation of H7N9 subtype infl uenza virus nucleic acid template by this method showed that specifi c fragments of the 263 bp of HA gene and 458 bp of NA gene could be amplifi ed，and other common subtype infl uenza viruses in this duplex RTPCR were negative. Sensitivity test results showed that the detection limit of the duplex RT-PCR method was 3 pg H7N9 virus templates. Compared with the results of virus isolation methods for testing30 clinical samples，the duplex RTPCR method showed that the coincidence rate was 100%. It was shown that the established duplex RT-PCR method was specifi c，rapid，sensitive，and accurate and it can be used for simultaneously detection of H7N9 infl uenza virus and differential diagnosis，and it provide technical support for effective prevention and control for H7N9 subtype infl uenza.

infl uenza virus；H7N9；duplex RT-PCR

S852.65

A

1005-944X（2015）05-0065-05

青島市科技計劃14-2-4-105-jch，國家自然基金31200123