寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗

吳亞文，李志紅，楊佳冰，張玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王曉亮，張和平，張學(xué)軍，王磊

（寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011）

寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗

吳亞文，李志紅，楊佳冰，張玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王曉亮，張和平，張學(xué)軍，王磊

（寧夏動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011）

[目的]了解寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌流行情況及主要病原菌的耐藥特征。[方法]采集寧夏地區(qū)5個規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場乳樣共計461份，分離培養(yǎng)后，應(yīng)用全自動細菌鑒定儀進行鑒定并選擇主要致病菌進行藥敏試驗。[結(jié)果]隱性乳房炎陽性檢出率平均為65.3%（301/461）；分離到金黃色葡萄球菌22株、無乳鏈球菌5株、大腸桿菌10株。這些細菌對阿米卡星、頭孢噻肟等藥物敏感，對青霉素與環(huán)丙沙星耐藥。[結(jié)論]寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎的陽性率較高，主要病原菌對阿米卡星、頭孢噻肟等藥物敏感。

奶牛；隱性乳房炎；病原菌；分離；鑒定；藥敏試驗

奶牛乳房炎為奶牛的常見病和多發(fā)病，是一種對乳業(yè)影響最大、危害最嚴(yán)重的常見疾病，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和生鮮乳質(zhì)量安全。引起奶牛乳房炎的病原微生物包括細菌、真菌、霉形體、酵母菌、病毒等80多種，也有報道稱多達150多種[1-2]。主要病原菌包括金黃色葡萄球菌（SA）、無乳鏈球菌（SAG）、大腸桿菌（CO）、其他鏈球菌（OS，或環(huán)境性鏈球菌ES）等；次要病原菌包括凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）、牛棒狀桿菌（CB）及其他細菌（OTH）等[2-5]。盡管奶牛規(guī)模化養(yǎng)殖越來越大，管理越來越規(guī)范，奶牛各種疾病，尤其是乳房炎發(fā)病率已成下降趨勢，但在一些中、小規(guī)模牛場和建場比較早的一些牛場，奶牛乳房炎，尤其是隱性乳房炎的發(fā)病率依然居高不下。臨床發(fā)現(xiàn)

的奶牛乳房炎多為隱性病例，多數(shù)臨床性乳房炎病例都是由隱性病例發(fā)展而來。由于隱性乳房炎造成不易察覺的產(chǎn)奶量隱性損失，常被忽視，且極易轉(zhuǎn)為臨床型乳房炎，帶來更大的損失。因此，及時了解和掌握引起寧夏地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)病的病原微生物的流行病學(xué)特點，對預(yù)防和治療隱性乳房炎有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 待檢材料

以寧夏地區(qū)5個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場泌乳奶牛（飼養(yǎng)規(guī)模均為500-600頭）為調(diào)查和研究對象，5個牛場分別采集非臨床性乳房炎乳樣118份、89份、89份、100份和65份。

1.2 試驗動物

ICR清潔級小鼠84只，體重約18-25g，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

無菌采集乳樣（每頭牛四個乳區(qū)乳樣混合），樣品采集后標(biāo)明耳標(biāo)號、日期，將取樣試管放在試管架上，放置裝有冰塊的便攜式冷藏箱中盡快送往實驗室。

1.4 儀器與設(shè)備

無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、全自動細菌鑒定儀（美國BD公司生產(chǎn)，型號為BD2011）等。

1.5 材料與試劑

5%綿羊血液瓊脂（購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；Baird Parker培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂、營養(yǎng)肉湯、革蘭氏染液、3%過氧化氫及1∶4兔血漿（1ml兔血漿加入3ml滅菌生理鹽水）（寧夏動物疾病預(yù)防控制中心實驗室自制）；BD鑒定肉湯管、BD藥敏肉湯管、BD藥敏指示劑、BD鏈球菌藥敏指示劑、BD革蘭氏陽性菌、陰性菌與鏈球菌鑒定藥敏符合板（購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司）。

1.6 細菌的分離與純化

將乳樣分別用無菌涂抹棒涂布于5%綿羊血液瓊脂、BP培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂的1/2區(qū)域上，3個平行。放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落涂片、革蘭氏染色并鏡檢，初步判定染色特性和形狀。

1.7 動物接種試驗

周岱翰曾治療過兩個同時查出肝癌的患者。其中一個到美國進行肝移植，另一個由他進行中藥調(diào)理。半年后，兩人在美國見面。肝移植的病人大哭不止，因為移植后他幾乎被完全監(jiān)護，開口怕吃錯，動手怕做錯，過得生不如死。而另一個病人在感覺癥狀減輕后便攜妻子周游世界。288天后，肝移植病人在痛苦中死去了。雖然另一人一年后也過世了，但在他生命最后的日子里，活得很滋潤，走得沒有遺憾。

為了減少下一實驗環(huán)節(jié)需要鑒定細菌的數(shù)量，進行動物接種試驗，選擇有致病力的細菌進行鑒定。用滅菌注射器吸取上述各種純化菌株的37℃ 24h肉湯培養(yǎng)物，腹腔注射健康小鼠，每只0.5ml，實驗組每種菌接種3只小鼠。隨機選取3只小白鼠，腹腔注射無菌肉湯0.5ml作為對照。觀察2d左右，記錄結(jié)果。

1.8 細菌的鑒定與藥敏試驗

結(jié)合上述動物接種實驗結(jié)果，挑取能使小白鼠發(fā)病的細菌純培養(yǎng)的菌落（同類型的主要病原菌每種選5株）接種于細菌鑒定儀的細菌鑒定藥敏復(fù)合板上，進行鑒定，隨后進行藥敏試驗。革蘭氏陽性菌接種于革蘭氏陽性菌鑒定藥敏復(fù)合板、革蘭氏陰性菌接種于革蘭氏陰性菌鑒定藥敏復(fù)合板，鏈球菌接種于鏈球菌鑒定藥敏復(fù)合板。培養(yǎng)37℃ 10～12 h后，讀取全自動細菌儀上的結(jié)果。

由于鑒定儀不能詳細地區(qū)分葡萄球菌屬的各種細菌，要進一步在Baird Parker培養(yǎng)基上培養(yǎng)葡萄球菌，觀察菌落形態(tài)特征，通過進行接觸酶試驗及血漿凝固酶試驗鑒定細菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離與純化

乳樣初培養(yǎng)后，24h觀察一次，48h再觀察一次。5個奶牛場乳樣病原菌檢出率培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計見表1。細菌染色、鏡檢可見細菌既有革蘭氏陽性菌又有革蘭氏陰性菌，可見葡萄串樣細菌、桿狀細菌和鏈狀細菌。

表1 5個牛場乳樣中隱性乳房炎病原菌檢出率

2.2 動物試驗

小鼠接種后，有56只在24～48h內(nèi)均表現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀，并開始死亡，其他小鼠僅表現(xiàn)短期精神沉郁。剖檢發(fā)病及死亡小鼠，多見肺淤血，肝臟被膜有出血點，腸管漿膜出血、臌氣等病理現(xiàn)象。做病變器官的組織觸片、染色鏡檢，均可見與相應(yīng)接種菌形態(tài)相似、染色特性一致的細菌。對照組3只小白鼠精神狀態(tài)良好，無異常癥狀。

2.3 細菌鑒定

2.3.1 乳樣中病原菌的分離率。結(jié)合儀器鑒定結(jié)果，隨后對葡萄球菌屬的細菌進行進一步的鑒定。在Baird Parker培養(yǎng)基形成圓形、隆起、灰色或黑色周圍帶沉淀線的菌落且接觸酶試驗陽性、血漿凝固酶試驗陽性的細菌，鑒定為金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗陰性的細菌，鑒定為凝固酶葡萄球菌。5個奶牛場乳樣中病原菌的鑒定情況分別見表2。

2.3.2 乳樣中的主要病原菌。動物試驗中使小鼠表現(xiàn)出臨床癥狀及死亡的細菌說明其有一定的致病性，按照臨床經(jīng)驗作為主要病原菌單獨列表如下（表3）。

表3 5個牛場乳樣中主要病原菌分離鑒定結(jié)果

通過5個奶牛場461份乳樣細菌培養(yǎng)分離鑒定的情況分析，本次調(diào)查中引起寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌（73%），低于郭海勇報道主要病原菌占細菌總數(shù)83.33%[6]。金黃色葡萄球菌是優(yōu)勢菌，與相關(guān)報道一致。這種狀況必然會導(dǎo)致我區(qū)生鮮乳體細胞計數(shù)、細菌計數(shù)水平升高，生鮮乳質(zhì)量安全隱患較大。

2.4 藥敏試驗的結(jié)果

通過對全自動細菌儀藥敏結(jié)果統(tǒng)計得知：金黃色葡萄球菌對阿米卡星、頭孢噻肟、慶大霉素與復(fù)方磺胺敏感，對青霉素與環(huán)丙沙星耐藥；無乳鏈球菌對阿米卡星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林藥物敏感，對克林霉素、氯霉素與四環(huán)素耐藥；大腸桿菌對阿米卡星與頭孢噻肟敏感，對頭孢唑啉、氨芐西林耐藥。

3 討論與小結(jié)

5個牛場奶牛隱性乳房炎主要病原菌中金黃色葡萄球菌分離率相對較高。金黃色葡萄球菌是定植于乳腺的傳染性病原微生物，較難防治。切斷傳播途徑是防止本病發(fā)生的有效措施，如擠奶器的消毒，擠奶人員衛(wèi)生意識的提高等。大腸桿菌，無乳鏈球菌是環(huán)境性病原微生物，這類病原菌常寄生在牛體表及周圍環(huán)境中。因此，搞好奶牛場的飼養(yǎng)管理，環(huán)境消毒，牛舍、牛床地面的清潔，糞便的及時處理，擠奶衛(wèi)生等措施尤為重要。在夏季時，應(yīng)注意消滅蚊蠅，保持牛體清潔，牛舍通風(fēng)，以減少或避免大規(guī)模發(fā)生乳房炎。

5個規(guī)?；膛瞿膛２≡腥韭势骄_65.3%，與郭海勇報道感染率為65.63%基本一致[6]，普遍高于奶業(yè)發(fā)達國家牛群乳房炎50%的防控指標(biāo)，稍高于劉東軍報道的62.7%[7]；檢出了各牛場隱性傳染性乳房炎感染牛，特別是危害較大的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌感染牛，金黃色葡萄球菌平均分離率為4.8%，有2個牛場即1場和2場金黃色葡萄球菌分離率達6.7%以上，接近于日本牛

群金黃色葡萄球菌乳房炎7%的防控指標(biāo)。從細菌的分離率結(jié)果可知凝固酶陰性葡萄球菌（53.4%）、金黃色葡萄球菌（4.8%）、牛棒狀桿菌（4.6%）、其他鏈球菌（3.0%）、大腸桿菌（2.2%）、無乳鏈球菌（1.1%、）其他細菌（1.3%）分別依次為我區(qū)奶牛乳房炎常見致病菌。凝固酶陰性葡萄球、牛棒狀桿菌的高檢出率表明我區(qū)擠奶程序、擠奶技術(shù)和擠奶衛(wèi)生消毒管理還不夠規(guī)范。雖說是次要病原菌，但也應(yīng)引起養(yǎng)殖戶的高度重視，以免導(dǎo)致更多臨床型乳房炎的發(fā)生。

主要致病菌進行藥敏試驗，結(jié)果表明細菌對青霉素、環(huán)丙沙星已產(chǎn)生耐藥性；對阿米卡星、頭孢噻肟藥物敏感，建議臨床可以使用。不同地區(qū)奶牛乳房炎病原菌對抗生素的敏感性呈現(xiàn)較大的差異，除了血清型的地區(qū)性差異這一原因外，抗生素的大量使用也是細菌產(chǎn)生抗藥性差異的直接原因，應(yīng)引起各奶牛場的足夠重視。

因此，牛場應(yīng)采取措施提高奶牛免疫力，強化擠乳衛(wèi)生要求，提高飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以減少健康牛發(fā)生隱性乳房炎；選擇有效的預(yù)防和治療藥物防止隱性乳房炎轉(zhuǎn)為臨床型乳房炎，從而避免重大經(jīng)濟損失的出現(xiàn)，仍然是奶牛乳房炎防控的要點。

[1]魏小娟，蒲萬霞，周緒正，等.蘭州地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（8）：113-114.

[2]烏倫吉如嘎，郭志凱，鄧常勝，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].畜牧與飼料科學(xué)，2012，33（10）：114-115.

[3]鄧海平，俞詩源，王玲，等.內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：595-596+598.

[4]張珠明，汪仁莉，何生虎.吳忠市奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，（17）：307-308.

[5]張中文，吳國娟，劉鳳華，等.北京地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2002，17（4）：42-47.

[6]郭海勇，韓國華，崔京春.大連地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：163-166.

[7]劉東軍.新疆石河子地區(qū)隱形乳房炎病原菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34（4）：22-23.

Isolation and Identifi cation of Subclinical Mastitis Pathogens and Drug Sensitivity Tests in Dairy Cows in Ningxia Autonomous Region

Wu Yawen，Li Zhihong，Yang Jiabing，Zhang Yuling，Li Lijuan，An Hongfei，Wang Yumei，Wang Xiaoliang，Zhang Heping，Zhang Xuejun，Wang Lei
（Ningxia Center for Animal Disease Control and Prevention，Yinchuan，Ningxia 750011）

[Objective] To clarify the species and distribution of cow sub-mastitis pathogens in Ningxia Hui Autonomous Region and identify the antimicrobial resistance of the main pathogens. [Method] 461 milk samples were collected from dairy cows with subclinical mastitis in five dairy farms for isolation and identification of pathogenic bacteria. Identification and drug sensitivity tests of the prominent pathogens were conducted by means of automatic bacteria identification equipment. [Result] The results indicated that the positive rate in the sub-mastitis cows was 65.3%（301/461）. Three pathogenic bacteria were isolated，including 22 Staphylococcus aureus strains，5 Streptococcus agalactiae strains and 10 Escherichia coli strains. These bacteria were resistant to penicillin and ciprofloxacin，but all showed susceptibility to cefotaxime and amikacin. [Conclusion] Pathogens isolated and identified in this experiment were susceptible to cefotaxime and amikacin.

dairy cow；sub-mastitis；bacteria；isolation；identification；drug sensitivity test

S858.23

A

1005-944X（2015）03-0004-04

寧夏回族自治區(qū)科技支撐項目（2013ZZN30）

張和平