人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性靶向肽的篩選及驗(yàn)證

劉 蕓　邱妙娟　邱柏欽　李錦梅

（南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部重大疾病的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515）

人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性靶向肽的篩選及驗(yàn)證

劉 蕓邱妙娟邱柏欽李錦梅

（南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部重大疾病的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515）

目的：利用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選與人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的多肽，為實(shí)現(xiàn)對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的靶向干預(yù)和開發(fā)針對急性肺損傷等呼吸系統(tǒng)疾病治療的導(dǎo)向藥物載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用全細(xì)胞篩選的方式，通過對人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞的4輪篩選和與人前列腺癌上皮PC-3細(xì)胞的差減篩選，從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選出與人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的多肽，選擇豐度較高的一條命名為NTG，用其構(gòu)建含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，層析法獲得重組蛋白His-NTG-EGFP，測定其分子質(zhì)量。向A549細(xì)胞和PC-3細(xì)胞分別加入含有重組蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果：從第1輪至第4輪，淘選所得的噬菌體回收率逐步提高，經(jīng)過PC-3細(xì)胞差減篩選，少量的與A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的噬菌體得到了回收。重組表達(dá)并純化得到的His-NTG-EGFP，測定其分子質(zhì)量為33 kD，與預(yù)期相符。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)融合蛋白His-NTG-EGFP處理后的A549細(xì)胞表面有綠色熒光分布，經(jīng)融合蛋白His-NTG-EGFP處理后的PC-3細(xì)胞以及經(jīng)對照蛋白處理的A549細(xì)胞和PC-3細(xì)胞表面均未出現(xiàn)綠色熒光，說明這一融合蛋白可以特異性結(jié)合A549細(xì)胞。結(jié)論：人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性靶向肽被成功獲得。

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞肺損傷，急性靶向肽 噬菌體展示篩選

急性肺損傷（ALI）是指各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，繼而造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全。作為機(jī)體重要的免疫屏障，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AT Ⅱ）通過分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)參與炎性細(xì)胞間的相互作用，對ALI中肺功能維持、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)有著極其重要的作用[1-2]。由于A549細(xì)胞系具有ATⅡ的結(jié)構(gòu)和生化特征，已被當(dāng)做常用的ATⅡ細(xì)胞模型[3-4]。本研究采用人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞作為模型，利用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選與其存在特異性結(jié)合的多肽，以期獲得能夠高效識別并靶向A549細(xì)胞的工具分子，實(shí)現(xiàn)對ATⅡ的靶向干預(yù)，以進(jìn)一步開發(fā)針對ALI等呼吸系統(tǒng)疾病治療的導(dǎo)向藥物載體。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料胎牛血清（FBS）、MEM（Eagles's minimum essential medium）細(xì)胞干粉培養(yǎng)基購自美國HyClone公司。蛋白酶抑制劑Cocktail 購自美國Sigma公司。MutanBEST 質(zhì)粒突變試劑盒購自日本TaKaRa公司；His·BindTMKit 購自美國BD公司；X-gal和IPTG購自廣州恒捷亞生物科技公司。噬菌體展示隨機(jī)環(huán)七肽文庫（Ph.D.7TMPhage Display Peptide Library Kit）購自美國New England Biolabs 公司（滴度為2.0×1013pfu/ml，宿主菌為E.coli ER2738）；人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞和人前列腺癌上皮PC-3細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物種質(zhì)庫（the American Type Culture Collection, ATCC）（培養(yǎng)條件：10% FBS、0.1 mmol/L非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基）；大腸桿菌BL21（DE3）菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET14b-MCS-EGFP質(zhì)粒由本科室自行改造保存。

1.2A549細(xì)胞特異性靶向肽的篩選以每孔5×106個(gè)細(xì)胞將A549細(xì)胞鋪入10 cm皿中，待長成單層貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)上清，貼壁的A549細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基沖洗3次，加入含0.1%BSA的培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min。加入噬菌體肽庫原液1×1011pfu， 37 ℃搖床溫和振搖孵育10 min，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。棄去未結(jié)合的噬菌體上清，細(xì)胞用含0.1%BSA的MEM培養(yǎng)基洗滌10次。用PBS和0.25%胰酶混合液（比例1∶1）消化，少量血清終止消化，5 000 r/min離心10 min，取部分離心后的上清（即淘選分離液）測定滴度，其余加入對數(shù)期E.coli ER2738進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后加入1/6體積的PEG/NaCl，顛倒混勻，4 ℃沉淀過夜。沉淀2次后，重懸沉淀于0.02%TBS中，得到噬菌體擴(kuò)增液，測定噬菌體滴度。重復(fù)以上步驟進(jìn)行第2、3、4輪篩選，各輪篩選得到的淘選分離液和擴(kuò)增液均用LB/IPTG/X-gal平皿培養(yǎng)測定噬菌體滴度。PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm皿中，待長成單層貼壁細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，加入第4輪得到的淘選分離液，孵育30 min。孵育結(jié)束后，收集未結(jié)合的噬菌體上清，得到差減后的人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性結(jié)合噬菌體懸液。

1.3A549細(xì)胞特異性靶向肽的氨基酸序列推導(dǎo)取噬菌體克隆擴(kuò)增液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，取電泳鑒定為陽性的噬菌體克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。根據(jù)編碼鏈中噬菌體pⅢ基因的閱讀框架推導(dǎo)出與pⅢ蛋白融合的外源七肽的氨基酸序列[5]。

1.4A549細(xì)胞特異性靶向肽和EGFP融合蛋白的表達(dá)純化根據(jù)測序結(jié)果，選擇豐度較高的七肽作為插入序列突變方法構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的原核表達(dá)載體。上 游 引 物 為：5'-aatactggttcgccttatgagtgc GGCTGCTAACAAAGC CCGAAA GG-3'；下游引物為：5'-acaagcagagtgagt GGATCCCTCGAG CTTGTACA GC-3'。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，接種于含有氨芐霉素（Amp+）的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至600 nm處吸光度（A600）為0.5～0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5～6 h。離心收集并超聲裂解細(xì)菌細(xì)胞，收集上清。將上清轉(zhuǎn)入加有Ni2+-NTA氨三乙酸瓊脂糖的層析柱中，依照His·BindTMKit操作說明，對重組融合蛋白進(jìn)行純化，并過濾除菌定量分析。

1.5A549細(xì)胞特異性靶向肽的驗(yàn)證于實(shí)驗(yàn)前1 d，以每孔7×103個(gè)細(xì)胞將A549或PC-3細(xì)胞鋪入petri皿中。待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%，用無血清MEM洗細(xì)胞表面3次，加入無血清MEM繼續(xù)培養(yǎng)30 min。然后加入含有終濃度為10 μmol/L的his-NTG-EGFP蛋白或his-EGFP對照蛋白的無血清MEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min后吸出培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，采用正置熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

2　結(jié) 果

2.1A549細(xì)胞特異性靶向肽的篩選結(jié)果篩選過程分為2個(gè)步驟：首先，通過4輪篩選獲得與A549細(xì)胞存在高親和力的噬菌體；然后，將第4輪篩選后得到的淘選分離液加入另一上皮細(xì)胞系—人前列腺癌上皮PC-3細(xì)胞中孵育，通過1輪差減篩選，收集未結(jié)合的噬菌體，最終獲得與A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的噬菌體。前4輪篩選過程中嚴(yán)格控制每輪加入的噬菌體數(shù)量為1×1011pfu，以保證篩選結(jié)果的穩(wěn)定性。選擇生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，進(jìn)行了全細(xì)胞模式的篩選。從第1輪至第4輪，淘選所得的噬菌體回收率逐步提高，而富集倍數(shù)在第3輪達(dá)到了最大值。富集倍數(shù)從上升支到下降支的變化，反映篩選已趨近飽和。即第3輪到第4輪篩選過程中，高豐度序列的富集優(yōu)勢更加明顯，而低豐度序列的擴(kuò)增壓力則越來越大的。考慮上述因素，我們的篩選進(jìn)行了4輪，并利用第4輪的淘選分離液進(jìn)行差減操作。經(jīng)過差減篩選，噬菌體的回收率為3.24×10-3，即大部分噬菌體與PC-3細(xì)胞發(fā)生了結(jié)合，而少量的與A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的噬菌體得到了回收。見表1。

表1　人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性靶向肽噬菌體展示篩選

2.2A549細(xì)胞特異性靶向肽的氨基酸序列推導(dǎo)差減篩選后得到的噬菌體克隆進(jìn)行部分初步測序，獲得插入序列并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)果9條多肽序列出現(xiàn)多次重復(fù)，選擇豐度較高的一條進(jìn)行靶向驗(yàn)證，即NTGSPYE，并命名為NTG。

2.3A549細(xì)胞特異性靶向肽與EGFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建和測序分析為了實(shí)現(xiàn)對靶向肽的驗(yàn)證，我們將以上多肽序列與EGFP融合構(gòu)建原核表達(dá)載體。由于序列片段較小，故采用了突變插入的方法，并對克隆進(jìn)行了測序分析以驗(yàn)證重組構(gòu)建成功。

2.4A549細(xì)胞特異性靶向肽與EGFP融合蛋白的表達(dá)和純化蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可溶性表達(dá)，利用Ni-NTA 親和層析法對超聲后破碎細(xì)胞后的上清進(jìn)行純化后，得到分子質(zhì)量約為33 kD的蛋白質(zhì)條帶（圖1），且純度達(dá)85%以上。

圖1　人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞特異性靶向肽與EGFP融合蛋白的純化結(jié)果

2.5A549細(xì)胞特異性靶向肽的驗(yàn)證融合蛋白或?qū)φ盏鞍追謩e與A549細(xì)胞和PC-3細(xì)胞共孵育30 min，可見，經(jīng)His-NTG-EGFP 融合蛋白處理后，A549細(xì)胞的表面出現(xiàn)綠色熒光分布。而相同條件下，該融合蛋白與PC-3細(xì)胞無明顯結(jié)合。在上述條件下，His-EGFP處理的兩種不同細(xì)胞表面，均未見熒光出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，NTG與A549細(xì)胞的結(jié)合具有一定特異性。見圖2（封三）。

3　討 論

ATⅡ又稱顆粒肺泡細(xì)胞，分散分布于ATⅠ肺泡細(xì)胞（ATⅠ）之間及其相鄰的肺泡間隔結(jié)合處。在正常的細(xì)胞更新及損傷修復(fù)過程中，它既可以分化為ATⅠ，也可以通過有絲分裂產(chǎn)生子代ATⅡ以維持自身的細(xì)胞群，扮演了肺泡上皮細(xì)胞“干細(xì)胞”的角色。ATⅡ的增殖、轉(zhuǎn)化與肺損傷及其修復(fù)有著密切的關(guān)系[6-7]。多種類型肺炎對ATⅡ存在影響，其表現(xiàn)的共同特點(diǎn)為ATⅡ出現(xiàn)肥大、增生，而增生的主要目是為修復(fù)上皮細(xì)胞。增生后的AT II 通過分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)參與炎性細(xì)胞間的相互作用，達(dá)到抗炎、促進(jìn)肺損傷修復(fù)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，ATⅡ具有復(fù)雜的免疫功能，它一方面能直接合成多種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，如補(bǔ)體C2、C3、C4、C5和白介素-3等；另一方面，其合成的重要產(chǎn)物肺表面活性物質(zhì)蛋白-A可與細(xì)菌表面脂多糖（LPS）中脂質(zhì)A結(jié)合，起到活化型配基的作用，調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞的各種功能，增加對微生物的吞噬作用[8-9]。因而，針對AT II進(jìn)行靶向干預(yù)治療，開展免疫功能調(diào)節(jié)，對于維持患者呼吸道正常炎癥反應(yīng)的平衡將發(fā)揮積極和重要的作用。

噬菌體展示技術(shù)基本原理是將編碼外源蛋白或多肽的基因片段插入編碼噬菌體外殼蛋白的基因中，使外源蛋白或多肽與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)在噬菌體表面，改造后的噬菌體仍然可以侵染細(xì)菌宿主。由一定長度的隨機(jī)肽段混合組成的噬菌體隨機(jī)肽庫，理論上包含了該長度所有可能的氨基酸排列信息。將噬菌體隨機(jī)肽庫加入到固定有特定的靶分子的體系中，如果展示在噬菌體表面的多肽能夠與靶分子發(fā)生有效的識別與結(jié)合，那么該噬菌體顆粒將被附著在受體的表面，從而與大量不存在結(jié)合的噬菌體相分離。通過幾輪生物淘洗后，就能高效、快速、簡便地從噬菌體隨機(jī)肽庫中篩選得到特異性的結(jié)合肽。近年來，噬菌體展示文庫技術(shù)的篩選模式得到了不斷的發(fā)展，除了傳統(tǒng)的固相篩選之外，利用完整的細(xì)胞以及特定的組織和器官作為靶標(biāo)的篩選方法都陸續(xù)得到完善。由于細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的生物體系，表面分布著大量的信號分子，可反映細(xì)胞的特性及所處的功能狀態(tài)，因此不同狀態(tài)和種類的細(xì)胞表面會(huì)存在著數(shù)量或/和結(jié)構(gòu)上具有差異的分子。相對于固相包被的方法，完整細(xì)胞篩選不需事先知道有關(guān)受體的信息，可保持細(xì)胞表面表達(dá)受體的完整構(gòu)象和生物學(xué)活性，能充分模擬自然條件下蛋白質(zhì)分子間的相互作用。目前，噬菌體展示技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用及結(jié)構(gòu)分析、噬菌體肽庫抗體篩選、抗原模擬表位的篩選、分子疫苗的研制、疾病的診斷和治療以及新藥物的篩選和開發(fā)等研究領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，尤其在靶向治療研究方面。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，利用噬菌體展示或其衍生技術(shù)發(fā)現(xiàn)的靶向肽配體，應(yīng)用于腫瘤的影像診斷、血管和基因靶向干預(yù)，以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他疾病的治療中[10-13]，并顯示良好的應(yīng)用前景。

本研究采用全細(xì)胞篩選的方式，利用噬菌體隨機(jī)肽庫對人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞進(jìn)行了4輪篩選，并采用PC-3細(xì)胞進(jìn)行了1輪差減篩選，獲得了與A549細(xì)胞存在特異性結(jié)合的多肽，利用增強(qiáng)綠色熒光標(biāo)記和熒光顯微觀察技術(shù)對多肽的靶向性進(jìn)行了初步驗(yàn)證。下一步，我們將采用更多的上皮細(xì)胞系并結(jié)合體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對多肽的靶向性進(jìn)行更廣泛和深入的研究，為未來急性肺損傷等呼吸系統(tǒng)疾病的靶向治療藥物開發(fā)奠定重要的基礎(chǔ)。

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Screening and verification of peptides specifically targeting human type II cell alveolar epithelial A549 cells

Liu Yun, Qiu Miaojuan, Qiu Boqin, Li Jinmei.
Department of Pathophysiology Southern Medical University, Key Laboratory of Proteome of Guangdong Provence, Key Laboratory of Transcriptome and Proteome of Major Diseases of Ministry of Education, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective: Phage random peptide library was screened to for the purpose of indentifying specific binding peptides of human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells, in order to provide experimental basis for targeting intervention to alveolar type II epithelial cells, and to develop drug carrier for respiratory disease such as acute lung injury. Methods: With whole cell model, four rounds of screening with the human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells and differential screening with human prostate epithelial PC-3 cells were carried out to acquire human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells specifically binding peptides from the phage random peptide library. Among them, the highly abundant one was chosen and referred as NTG to construct prokaryotic expression vector fused with enhanced green fluorescent protein (EGFP). After transforming competent cells chromatography purified recombinant protein his-NTG- EGFP and its molecular mass was measured. The medium containing recombinant protein his-NTG-EGFP or his-EGFP was added to A549 cells and PC-3 respectively for fluorescence microscopy. Results: From the 1st to the 4th round, the phage recovery gradually increased. After PC-3 cell differential screening, a small amount of A549 cells specifically binding peptides were harvested. After recombinant expression and purification, as expected, the molecular weight of his-NTG-EGFP was determined as 33 kD. Under fluorescence microscope, as green fluorescence appeared on the surface of A549 cell treated with his-NTG-EGFP, but not on the surface of PC-3 cells incubated with his-NTG-EGFP, or PC-3 cells and A549 cells that were cultured with control protein his-EGFP, it suggested that the fused protein could bind specifically to A549 cells. Conclusions: Human alveolar type Ⅱ epithelial A549 cells specifically targeting peptide is acquired successfully.

Alveolar type II epithelial cellsAcute lung injuryTargeting peptidesPhage display screening

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2015. 04. 005

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81100008）；南方醫(yī)科大學(xué)科研啟動(dòng)計(jì)劃（B1012008）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金面上項(xiàng)目（A2013354）

（2015-08-25）