二羥二丁基醚及其手性雜質(zhì)的毛細管GC法分離

張玉霞，李　丹，林　潔，康天懌，陳芙蓉，寧　欣，徐小平

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

二羥二丁基醚及其手性雜質(zhì)的毛細管GC法分離

張玉霞，李丹，林潔，康天懌，陳芙蓉，寧欣，徐小平

（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

采用毛細管氣相色譜法（CGC）分別對二羥二丁基醚（DHDB）及手性雜質(zhì)的分離條件進行考察，建立二羥二丁基醚（DHDB）含量的測定方法。PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm）毛細管柱為色譜柱，F(xiàn)ID為檢測器，正辛醇作為內(nèi)標(biāo)，DHDB手性雜質(zhì)程序升溫條件為初溫120℃，以0.5℃/min升溫至180℃，保持40min；DHDB含量測定程序升溫條件為140℃保持1min，以20℃/min升至200℃。DHDB及其手性異構(gòu)體得到完全分離；DHDB在66.70～800.1μg/mL的范圍具有良好的線性關(guān)系（y=0.0070x+0.0554；r2=0.9996）；平均回收率為99.54%，重復(fù)性RSD為0.68%，中間精密度RSD為0.95%，樣品的平均含量為77.92%（RSD=0.25%）。該方法快速、簡便，適于DHDB手性雜質(zhì)分析和含量測定。

毛細管GC；二羥二丁基醚；手性雜質(zhì)；含量測定

0　引　言

二羥二丁基醚（DHDB）屬于膽汁分泌雙相促進劑，具有利膽、消炎、解痙、護肝、降脂、排石、增加膽汁分泌的作用，可用于膽道結(jié)石及膽囊炎、膽管炎等多種慢性膽道感染的治療，是一種高效的利膽劑、膽石溶解劑和保肝藥[1-3]，因此倍受關(guān)注。然而，DHDB結(jié)構(gòu)中的兩個手性碳和潛在的多位取代雜質(zhì)，使得DHDB及其雜質(zhì)的檢測尤為困難，迄今，國內(nèi)外未見關(guān)于DHDB原料藥及制劑質(zhì)量的研究。根據(jù)相關(guān)文獻報道，其常見的檢測手段主要有氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），如Serena等[4]以GC-MS分離鑒定了DHDB主成分及其雜質(zhì)異構(gòu)體；朱曉桐[5]采用GC法分離檢測了DHDB；李志萬[6]以手性GC法對DHDB原料藥和雜質(zhì)等手性組分進行了完全分離。本文針對二羥二丁基醚手性化合物具有幾何異構(gòu)雜質(zhì)和光學(xué)異構(gòu)雜質(zhì)的特性，同時為了滿足二羥二丁基醚含量測定中需要單峰檢出的要求，分別篩選適合分離二羥二丁基醚手性異構(gòu)雜質(zhì)[7-8]和二羥二丁基醚含量測定的色譜條件，建立了二羥二丁基醚單峰含量測定方法[9-11]，為二羥二丁基醚及其制劑的進一步質(zhì)量研究提供較好的分析方法。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器

GC-7890氣相色譜儀（上海天美公司）；XW-80A旋渦振蕩器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；BT-125D電子天平（Sartorius，德國）；PCF-10超純水機（成都品成科技有限公司）。

1.1.2試劑

二羥二丁基醚和對照品（純度：77.46%）（自制，四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥物化學(xué)系提供）；正辛醇（色譜純，天津市博迪化工有限公司）；十二烷（AR，成都市科龍化工試劑廠），水為自制超純水。正戊醇（色譜純）、丙酮（AR）均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3溶液的配制

對照品溶液的制備：取二羥二丁基醚對照品250 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)儲備液1mL，加丙酮至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取上述儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，加丙酮至刻度，搖勻得到含二羥二丁基醚250μg/mL溶液作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取樣品250mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)儲備液1 mL，用丙酮定容至刻度，搖勻。精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，丙酮定容至刻度，制得250μg/mL二羥二丁基醚作為供試品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密量取正辛醇4.0mL（500mL/ 413.5），置于100mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，制成33.08mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2色譜柱的篩選

以二羥二丁基醚主成分的柱效及峰的對稱性和雜質(zhì)2異構(gòu)體的分離度等色譜參數(shù)為指標(biāo)，分別考察了OV-624（30 m×0.53 mm×0.5 μm）、OV-17（30 m× 0.53 mm×1.0μm）、PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm）等色譜柱。其中，OV-624柱對主成分表現(xiàn)出較高的柱效，但峰有拖尾，且雜質(zhì)2的手性異構(gòu)體不能分離；OV-17柱的對主成分的柱效和對稱性均較差，且雜質(zhì)2手性異構(gòu)體不能分離；PEG-20M柱主成分峰和異構(gòu)體峰均表現(xiàn)出較好的柱效和分離度，雜質(zhì)2的兩個手性異構(gòu)體能較好分離，分析時間較短，既能夠滿足二羥二丁基醚主成分的定量，也能夠滿足各雜質(zhì)的有效分離，最終確定為本實驗的色譜柱。

1.2.1程序升溫對二羥二丁基醚及其手性雜質(zhì)分離的影響

據(jù)二羥二丁基醚主成分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)特點，柱溫分別選取了程序升溫100℃→180℃，120℃→180℃和140℃→180℃進行研究，升溫速率均為0.5℃/min。結(jié)果表明，從起始溫度100℃升至180℃時，保留時間過長，且峰形不好；采用140℃升至180℃時，二羥二丁基醚主成分的手性異構(gòu)體不能完全分開；從120℃升至180℃時，二羥二丁基醚主成分峰分離度以及峰形較好，故確定此條件為分離的柱溫條件。

綜合上述色譜柱的篩選結(jié)果，確定二羥二丁基醚和雜質(zhì)手性異構(gòu)體的色譜條件：以正辛醇作內(nèi)標(biāo)物，毛細管色譜柱PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm），程序升溫為120℃起始，升溫速率0.5℃/min升至180℃，保持40 min。進樣溫度為250℃；檢測器（FID）溫度為250℃，流量：3mL/min，分流比98∶2。如圖1（a）所示。

1.2.2程序升溫對二羥二丁基醚定量的影響

為避免二羥二丁基醚主成分手性成分的裂分，分別選取了140℃、180℃等溫條件和程序升溫120℃→180℃、140℃→180℃、140℃→200℃、40℃→220℃，共6個溫度進行研究，結(jié)果表明，程序升溫140℃→200℃時，即140℃初始，保持1 min后，以20℃/min的速度升至200℃，二羥二丁基醚主成分峰的柱效、對稱性和分離度均較其他幾個溫度下的結(jié)果更好。

故確定PEG-20M毛細管柱（30 m×0.53 mm× 1.0 μm）；檢測器（FID）溫度：250℃；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度為140℃，保持1min后，以20℃/min的速度升至200℃；載氣（N2）：3mL/min；氫氣：50mL/min；空氣：50mL/min；尾吹（N2）：50mL/min為二羥二丁基醚定量的色譜條件，如圖1（b）所示。

圖1　二羥二丁基醚定量色譜圖和手性雜質(zhì)色譜圖

1.2.3內(nèi)標(biāo)

據(jù)二羥二丁基醚的沸點及其化學(xué)性質(zhì)，分別對比了十二烷、正辛醇、正戊醇與二羥二丁基醚的分離情況。結(jié)果表明，正辛醇與二羥二丁基醚出峰時間接近，并且能完全分離，因此選定正辛醇為內(nèi)標(biāo)。

1.3二羥二丁基醚中手性雜質(zhì)的檢測

1.3.1精密度和重復(fù)性考察

精密量取1μL供試品溶液注入氣相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄二羥二丁基醚的色譜圖，精密度良好。6次樣品峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.53%和0.38%。

制備6份供試品溶液，分別精密量取1μL中等濃度供試品溶液即含二羥二丁基醚約250μg/mL的供試品溶液反復(fù)測定，記錄二羥二丁基醚色譜圖，6份樣品峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.25%和1.15%，重復(fù)性高。

1.3.2面積歸一化法定量手性雜質(zhì)

分別精密量取3批小試樣品各適量，按照“1.1.3”項下供試品溶液配制，精密量取各供試品溶液1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，經(jīng)面積歸一化法計算3批二羥二丁基醚手性雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的平均含量，分別為12.78%和9.67%。

1.4二羥二丁基醚的含量測定

目前，二羥二丁基醚含量的測定主要有兩種方法：1）將其主成分分開測定其含量；2）測量其主成分異構(gòu)體總的含量。為了遵循該藥品的進口藥標(biāo)準(zhǔn)，采用的后一種測定方法。

1.4.1方法學(xué)考察

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限。精密稱量二羥二丁基醚對照品266.7 mg于100mL容量瓶，加入1mL內(nèi)標(biāo)儲備溶液，用丙酮定容至刻度，搖勻，得2.667mg/mL對照品儲備液；分別精密量取該儲備溶液適量置于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻，制成含二羥二丁基醚66.7，133.4，266.7，533.4，800.1μg/mL的線性驗證溶液。精密量取1μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，二羥二丁基醚在66.7～800.1μg/mL之間有良好的線性關(guān)系，如圖2所示；取線性研究中對照品溶液（125 μg/mL）逐級稀釋，測得二羥二丁基醚檢出限和定量限分別為0.025ng（S/N≥3）和0.125ng（S/N≥10）。

圖2　二羥二丁基醚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2）精密度與重復(fù)性的考察。精密量取1μL供試品溶液注入氣相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄二羥二丁基醚的色譜圖，6次樣品峰高與內(nèi)標(biāo)峰高比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%，精密度良好。經(jīng)考查中間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%，說明中間精密度良好。

制備6份供試品溶液，分別精密量取1μL中等濃度供試品溶液即含二羥二丁基醚約250μg/mL的供試品溶液反復(fù)測定，記錄二羥二丁基醚色譜圖，6份樣品峰高與內(nèi)標(biāo)峰高比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68%，重復(fù)性好。

3）加樣回收率。分別精密量取對照品儲備液（2.5mg/mL）適量，于3個10mL容量瓶，丙酮溶解并稀釋至刻度，制成高、中、低（含二羥二丁基醚300，250，200μg/mL）3個不同濃度的對照品溶液。取250μg/mL供試品溶液各1mL于9只離心管，分別精密加入高、中、低對照品溶液1mL（即每個濃度制3份）。精密量取1μL注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果表明，樣品平均回收率為99.54%，回收率RSD為1.16%，說明本方法準(zhǔn)確度滿足實驗要求。

1.4.2DHDB的含量測定

分別精密量取樣品適量，按照“1.1.3”項下供試品溶液配制，精密量取各供試品溶液1μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，由二羥二丁基醚的色譜峰高與內(nèi)標(biāo)峰高的比值，經(jīng)內(nèi)標(biāo)法計算二羥二丁基醚的百分含量。6批二羥二丁基醚的含量測定（A供試品/A對照品× C對照品×100%）結(jié)果見表1，總平均含量為77.92%，符合二羥二丁基醚進口標(biāo)準(zhǔn)含量大于50%的要求。

表1　6批DHDB原料藥含量測定結(jié)果（n=4）

2　討　論

根據(jù)二羥二丁基醚的結(jié)構(gòu)特點和文獻表明，分離二羥二丁基醚及其雜質(zhì)常見的色譜柱有PEG-20M柱和OV-624柱。其中PEG-20M柱是目前二羥二丁基醚藥典標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定柱，而且PEG-20M柱適合分離極性較強的醇、酚、醚類化合物。所以，本文重點采用了PEG-20M的毛細管柱作為實驗柱。

二羥二丁基醚為手性化合物，根據(jù)藥品仿制標(biāo)準(zhǔn)的要求，需要對二羥二丁基醚進行單峰定量檢測，從而避免了目前二羥二丁基醚手性異構(gòu)體對照品難以獲得的問題，確保二羥二丁基醚主成分快速有效定量。本文選擇了初始柱溫為140℃，以20℃/min的速率升溫到200℃時，二羥二丁基醚與幾何異構(gòu)體得到了完全分離，為二羥二丁基醚的含量測定提供基本條件。

另一方面，針對雜質(zhì)的分離，實驗需要在完全分離幾何異構(gòu)體雜質(zhì)的基礎(chǔ)上同時分離各幾何雜質(zhì)包含的手性異構(gòu)雜質(zhì)。為此，本文在降低初始柱溫至120℃的基礎(chǔ)上,采用較低的升溫速率（0.5℃/min）升溫至180℃，并保持40min的程序，使二羥二丁基醚及其兩個幾何異構(gòu)雜質(zhì)中的手性異構(gòu)體均被完全分離，為二羥二丁基醚中手性雜質(zhì)的檢查提供基礎(chǔ)條件。

由于二羥二丁基醚的分子結(jié)構(gòu)中存在兩個手性中心，即理論上應(yīng)有4個手性異構(gòu)體，3個組份應(yīng)有10個手性異構(gòu)體。然而，即便是最新的手性色譜柱也僅能檢測8個手性組份峰。而采用PEG-20M柱檢出了6個手性異構(gòu)體峰。分析原因可能與合成工藝相關(guān)，或個別手性異構(gòu)體含量過低未能被直接檢出。

3　結(jié)束語

本文采用PEG-20M的毛細管柱的程序升溫GC法，所建立的分離手性異構(gòu)的條件和分離二羥二丁基醚單峰用于含量測定色譜條件，具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點，能夠滿足二羥二丁基醚的質(zhì)量研究。是二羥二丁基醚手性雜質(zhì)分析和二羥二丁基醚含量測定的較好方法。

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CGC separation of DHDB and chiral impurities

ZHANG Yuxia，LI Dan，LIN Jie，KANG Tianyi，CHEN Furong，NING Xin，XU Xiaoping
（School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Capillary Gas Chromatography（CGC）has been adopted to determine the content of dihydroxydibutylether（DHDB） basedontheseparationconditionsofDHDBanditschiral impurities.Chromatographic column：PEG-20M capillary column（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；detector: flame ionization detector（FID）；internal standard（IS）：n-Octano.The separation conditions of DHDB and its chiral impurities are as follows：The column temperature was programmed from 120℃ to 180℃ at the rate of 0.5℃/min and then stayed there for 40 min.The assaying conditions of DHDBareasfollows：Thecolumntemperaturestayedat140℃foroneminuteandthen programmed to 200℃at the rate of 20℃/min.DHDB and its chiral impurities have been completely separated.The liner relationship of DHDB is good within the range of 66.70 μg/mL to 800.1 μg/mL（y=0.007 0x+0.055 4；r2=0.999 6）.Theaveragerecovery，repeatabilityRSD，intermediate precision RSD and mean content are 99.54%，0.68%，0.95%and 77.92% （RSD=0.25%）respectively.The two chromatographic conditions established are suitable for separating DHDB from its chiral impurities and determining the content of DHDB.It is convenient，fast and practical.

CGC；dihydroxydibutylether；chiral impurities；content detecting

A

1674-5124（2015）12-0041-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.12.011

2015-03-20；

2015-05-07

張玉霞（1990-），女，四川綿陽市人，碩士研究生，專業(yè)方向為藥物質(zhì)量控制與藥物代謝分析。

徐小平（1962-），男，四川宜賓市人，副教授，碩士，主要從事藥品質(zhì)量控制研究。