唐 慧 王朵勤沈燕蕓 徐金華
·論著·
屋塵螨變應(yīng)原 Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類胰蛋白酶的影響
唐 慧 王朵勤#沈燕蕓 徐金華?
目的: 明確屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞系HMC-1釋放類胰蛋白酶的影響。方法:培養(yǎng)后的HMC-1細(xì)胞分為單純培養(yǎng)液組、5μg/mLDerp1組和5μg/mLDerp1+100μmol/LPAR2拮抗劑(FSLLY)組,用ELISA方法檢測(cè)各組類胰蛋白酶水平,顯微鏡觀察HMC-1細(xì)胞脫顆粒率。結(jié)果:培養(yǎng)液組,Derp1組和Derp1+FSLLRY組中類胰蛋白酶水平分別為31.12±3.60 ng/mL、70.40±1.55 ng/ mL和56.72±2.66 ng/mL。Derp1組和Derp1+FSLLRY組肥大細(xì)胞脫顆粒率分別為66.67%和16.67%。結(jié)論: 屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過激活人肥大細(xì)胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶。
屋塵螨; 肥大細(xì)胞; 蛋白酶激活受體2; 類胰蛋白酶
瘙癢幾乎是所有過敏性皮膚病的共同癥狀,尤其是慢性瘙癢可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,如何控制慢性瘙癢也是臨床的難題之一。肥大細(xì)胞是瘙癢發(fā)生中的關(guān)鍵細(xì)胞之一,其活化脫顆粒后可產(chǎn)生多種介質(zhì),如組胺、類胰蛋白酶等。1類胰蛋白酶是重要的致癢介質(zhì),通過神經(jīng)源性的機(jī)制調(diào)節(jié)皮膚的免疫,并參與瘙癢的發(fā)生。2屋塵螨是引起過敏性皮膚病或其他系統(tǒng)過敏性疾病的最常見的環(huán)境變應(yīng)原之一。也是蛋白酶激活受體2(PAR2)的天然受體。3因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究屋塵螨變應(yīng)原Derp1通過PAR2信號(hào)通路對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒釋放類胰蛋白酶水平的影響。
1.1 材料 人肥大細(xì)胞HMC-1細(xì)胞株由Butterfield實(shí)驗(yàn)室(Mayo Clinic,Rochester,USA)饋贈(zèng),類胰蛋白酶ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RND公司,SLIGRL-NH2 (PAR2活化劑)、和FSLLRY(PAR2抑制肽)購(gòu)自Tocris公司,屋塵螨Derp1購(gòu)自abnova公司,倒置顯微鏡(Nikon,Japan),細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo electron co,USA),胎牛血清(Gibco),青霉素(Gibco),Poly-L-lysine(Sigma,USA)。
1.2 人肥大細(xì)胞HMC-1培養(yǎng)與激發(fā)4HMC-1細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),用細(xì)胞培養(yǎng)液0%(v/v)胎牛血清(FBS),20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸,0.01%(v/v)硫代甘油,2 mmol/L L-谷氨酰胺,鏈霉素和盤尼西林/青霉素)于37℃、5%(v/v)CO2、濕度為95%的無(wú)菌環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),6孔板每孔5×105,設(shè)3個(gè)重復(fù),將5μg/mL Derp1、100μmol/L FSLLY+5μg/
mL Derp1及細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理細(xì)胞,于30 min后終止反應(yīng),4℃條件下1500 r/min離心10 min后收集上清置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>
1.3 ELISA方法檢測(cè)類胰蛋白酶水平 用類胰蛋白酶ELISA試劑盒按照操作說明檢測(cè)上述實(shí)驗(yàn)收集的上清液中類胰蛋白酶水平。
1.4 人肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒率 將HMC-1用Poly-L-lysine固定至載玻片上,用凡士林固定在顯微鏡槽中,在顯微鏡下觀察用 5μg/m L Derp1、100 μmol/L FSLLY+5μg/mL Derp1及細(xì)胞培養(yǎng)液分別處理HMC-1細(xì)胞30 min前后觀察細(xì)胞形態(tài)變化,對(duì)HMC-1細(xì)胞的脫顆粒情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。肥大細(xì)胞脫顆粒計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為,肥大細(xì)胞細(xì)胞膜破裂且有顆粒散落在周圍認(rèn)為為肥大細(xì)胞脫顆粒。脫顆粒率=脫顆粒肥大細(xì)胞/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%。5
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05時(shí)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2.1 屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類胰蛋白酶水平的影響 見表1、圖1。Derp1和細(xì)胞培養(yǎng)液組分別作用于HMC-1 30 min后類胰蛋白酶水平分別為70.40±1.55 ng/mL及31.12±3.60 ng/ mL。經(jīng)統(tǒng)計(jì),屋塵螨變應(yīng)原Derp1組釋放類胰蛋白酶的水平明顯高于細(xì)胞培養(yǎng)液組(P<0.05),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1 不同藥物刺激下人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類胰蛋白酶的水平
圖1 不同藥物刺激下人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類胰蛋白酶的水平
2.2 屋塵螨變應(yīng)原Derp1和PAR2抑制劑FSLLY聯(lián)合作用對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1釋放類胰蛋白酶水平的影響 見表1、圖1。Derp1與 FSLLY共同作用HMC-1 30 min后類胰蛋白酶水平為56.72±2.66 ng/ mL,較Derp1單獨(dú)作用時(shí)明顯降低(P<0.05),較細(xì)胞培養(yǎng)液組依然明顯增高(P<0.05),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.3 屋塵螨變應(yīng)原Derp1對(duì)人肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒水平的影響 見圖2a及2b細(xì)胞培養(yǎng)液孵育HMC-1 30 min后,顯微鏡視野內(nèi)的細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài),細(xì)胞膜表面光滑,見圖3a及3b,Derp1作用于HMC-1 30 min后,細(xì)胞發(fā)生了明顯的脫顆粒情況,肥大細(xì)胞脫顆粒率為66.67%。
2.4 屋塵螨變應(yīng)原Derp1和PAR2抑制劑FSLLY聯(lián)合作用對(duì)肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒水平的影響 見圖4a和4b。相比較于Derp1組,Derp1與FSLLRY共同作用于HMC-1 30 min后,細(xì)胞脫顆粒情況被明顯抑制,肥大細(xì)胞脫顆粒率為16.67%。
過敏性皮膚病是皮膚科的常見病,發(fā)病率逐年增多,部分患者還同時(shí)合并哮喘或過敏性鼻炎等其他過敏性疾病。常見的過敏性皮膚病中,瘙癢是其共同的癥狀,但是目前針對(duì)慢性瘙癢卻缺乏切實(shí)有效的治療手段。反復(fù)的瘙癢-搔抓的惡性循環(huán)除了會(huì)加劇皮疹之外,還會(huì)嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。因此如何防治慢性瘙癢應(yīng)當(dāng)是目前皮膚科的研究重點(diǎn)之一。
以往大規(guī)模的變應(yīng)原檢測(cè),發(fā)現(xiàn)吸入性變應(yīng)原(主要是屋塵螨和粉塵螨)是引起過敏性皮膚病的重要誘因6而且在具有慢性瘙癢的特應(yīng)性皮炎等疾病中,持續(xù)性的接觸屋塵螨與疾病的加重有關(guān)。7既往研究認(rèn)為,屋塵螨可通過I型變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺引起瘙癢,但這只能解釋部分情況。8現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)屋塵螨的提取物通過活化PAR-2,可導(dǎo)致呼吸道黏膜下腺體的分泌增加,并可以引起肺的感覺神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加,9,10由此可見屋塵螨可以通過與PAR-2的作用參與疾病的發(fā)生。PARs屬于與G蛋白偶聯(lián)受體家族,有四個(gè)成員:PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。11,12PAR2分布于各種組織和細(xì)胞表面,主要包括人皮膚肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、活化的內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元和星形細(xì)胞等。9,10肥大細(xì)胞是瘙癢發(fā)病中的關(guān)鍵細(xì)胞之一,其釋放的組胺和類胰蛋白酶都是重要的致瘙癢的介質(zhì),尤其是后者與慢性瘙癢密切相關(guān)。13因此我們針對(duì)屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號(hào)通路-肥大細(xì)胞-類胰蛋白酶途徑進(jìn)行研究,以期闡明這一途徑的分子機(jī)制。
圖2 細(xì)胞培養(yǎng)液孵育30min后,顯微鏡視野內(nèi)的人肥大細(xì)胞HMC-1處于穩(wěn)定狀態(tài),細(xì)胞膜表面光滑 a:細(xì)胞培養(yǎng)液孵育前;b:細(xì)胞培養(yǎng)液孵育30min后 圖3 屋塵螨變應(yīng)原Derp1孵育后,人肥大細(xì)胞HMC-1發(fā)生了明顯的脫顆粒情況 a:屋塵螨變應(yīng)原Derp1孵育前;b:屋塵螨變應(yīng)原Derp1孵育30 min后 圖4 屋塵螨變應(yīng)原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育后,人肥大細(xì)胞HMC-1脫顆粒情況被明顯抑制 a:屋塵螨變應(yīng)原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育前;b:屋塵螨變應(yīng)原Derp1與拮抗劑FSLLRY共同孵育30 min后
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PAR2激活劑SLIGRL-NH2可明顯引起人肥大細(xì)胞HMC-1類胰蛋白酶釋放,證實(shí)了HMC-1細(xì)胞表面PAR2受體的存在。屋塵螨變應(yīng)原Derp1單獨(dú)作用于HMC-1細(xì)胞可明顯引起HMC-1細(xì)胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶,其水平明顯高于正常對(duì)照,表明屋塵螨變應(yīng)原Derp1是人肥大細(xì)胞HMC-1活化的重要刺激物。而將屋塵螨變應(yīng)原Derp1與PAR2拮抗劑FSLLRY共同作用于HMC-1細(xì)胞時(shí),可部分抑制HMC-1細(xì)胞脫顆粒引起類胰蛋白酶的釋放,因此我們認(rèn)為屋塵螨變應(yīng)原Derp1可以通過激活人肥大細(xì)胞HMC-1表面PAR2受體引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放類胰蛋白酶,但這并不是唯一途徑。本研究通過對(duì)屋塵螨變應(yīng)原-PAR2信號(hào)通路-肥大細(xì)胞-類胰蛋白酶這一途徑的研究,明確其在慢性瘙癢中所發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制,從而為臨床新的治療提供切實(shí)的理論基礎(chǔ),為真正解決臨床實(shí)際問題提供幫助。
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Effect of house ductm ite Derp1 on the secretion of tryptase from human mast cell line HMC-1
TANG Hui,WANGDuo-qin,SHEN Yan-yun,et al.Department ofDermatology,Huashan Hospital,F(xiàn)udan U-niversity,Shanghai,200040
Objective:To determine the effect of house dustmite Derp1 on the secretion of typtase from human mast cell line HMC-1.Methods:After cultured HMC-1 cellswere incubated respectivelywith Derp1 5μg/mL and Derp1 5μg/mL+PAR2 antagonist(FSLLY)100μmol/L.The level of typtase from HMC-1 cells was detected by ELISA.The degranulation of HMC-1 cells was observed under microscope.Results: The levels of the typtase from HMC-1 cells in culturemedium group,Derp1 group and Derp1 combined FSLLY group were 31.12±3.60 ng/mL,70.40±1.55 ng/mL and 56.72±2.66 ng/mL,respectively.The degranulation rates in Derp1 group and Derp1 combined FSLLY group were 66.67%and 16.67%.Conclusion:The PAR2 receptor can be activated by house dustmite Derp1,which results in typtase secretion of the human mast cell line HMC-1.
house dustmite;mast cell;protease activated receptor 2;typtase
國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào):81402603)上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(編號(hào):20124y032)
復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院,上海,200040#為共同第一作者?通信作者