蓽茇寧衍生物對高脂血癥大鼠調(diào)脂作用及其機制的研究

阿 榮，喬延江，博·格日勒圖，昭日格圖，包力爾

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學理學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102;3.北京中醫(yī)藥大學中藥信息工程研究中心，北京 100102;4.內(nèi)蒙古大學蒙藥化學研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

高脂血癥(Hyperlipidemia，HLP)是一種代謝性疾病，表現(xiàn)為一種或幾種脂類代謝失調(diào)導致的血漿中脂類含量異常，常引起動脈粥樣硬化，冠心病，心肌梗死等疾?。?］。研究也表明HLP的預防治療可以減少心腦血管疾病的發(fā)生，提高生活質(zhì)量。但是現(xiàn)今治療HLP的藥物如他汀類調(diào)脂藥和貝特類調(diào)脂藥，其不良反應影響臨床應用，因此尋找安全，有效，低毒的降脂藥物具有一定的積極意義。

蓽茇寧(GBN)是從常用中蒙藥胡椒科藤本植物蓽茇(Piper longum L.)中提取分離出的有效單體成分，具有降脂作用，但其降脂程度有限［2］。因此本課題組在蓽茇寧基礎(chǔ)上進一步得到其去烴基衍生物(GBNT)(化學式如圖1)，來探討其對高脂血模型大鼠是否具有調(diào)脂作用，是否更有治療效果。

1 材料

1.1 實驗動物 Wister大鼠，體重(200±10)g，清潔級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證［SCXK(京)2012－0004］。室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2 藥物與試劑 GBNT由本課題組制備，其純度高于98.0%;辛伐他汀片，購于廣東彼迪藥業(yè)股份有限公司(批號20140303);總膽固醇測定試劑盒(TC)，甘油三酯測定試劑盒(TG)，低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(LDL-C)，高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(HDL-C)均購于中生北控生物科技股份有限公司;卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，低密度脂蛋白受體(LDLR)均購于Epitmics公司;膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)購于Abcam公司;β-actin購于碧云天生物技術(shù)研究所;BCA試劑盒購于cwbiotech公司。

1.3 儀器 PRONTO EVOLUTION全自動生化儀，意大利產(chǎn);上海驥輝科學分析儀器有限公司;BSA/24S型電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司;真空冷凍干燥機，意大利TELSTAR;UV－1601紫外可見分光光度計，日本島津;迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，北京市六一儀器廠;ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)，Bio－Rad公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 60只Wistar大鼠，隨機分為六組:正常組，模型組，GBN組，GBNT低劑量組，GBNT高劑量組，陽性組(辛伐他汀)，每組10只。參照文獻［3－4］，制備高脂飼料，除正常組外，其余每組每天給予定量高脂飼料，正常組給予基礎(chǔ)飼料。GBN組灌服 10 mg·kg－1·d－1，陽性組灌服 10 mg·kg－1·d－1，GBNT 低劑量組灌服 5 mg·kg－1·d－1，GBNT 高劑量組灌服 10 mg·kg－1·d－1，正常組和模型組每天灌服等體積溶媒，連續(xù)給藥8周后各組大鼠腹主動脈取血，并取肝臟標本。血清及標本－80℃凍存，進行各項指標的檢測。

2.2 血脂測定 按照試劑盒說明書進行血清TC，TG，LDL-C，HDL-C 含量檢測。

2.3 肝臟病理形態(tài)學檢測 將固定好的肝臟標本，進行石蠟包埋，切片，HE染色。

2.4 Western blot 收集處理過的樣本，加入裂解液裂解，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣，SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4°C孵育過夜。次日加二抗孵育后曝光。

3 結(jié)果

3.1 GBNT對高血脂模型大鼠血脂水平的影響相對于正常組，模型組中血清TC，TG，LDL-C含量顯著升高(P ＜0.01)，HDL-C 含量下降(P ＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義;實驗組中GBNT低、高劑量組能顯著抑制模型中血清 TC，TG，LDL-C含量的上升，HDL-C含量的下降(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義;GBN組和辛伐他丁陽性組中大鼠血清中TC，TG，LDL-C含量也均有下降(P＜0.05)，HDL-C(P＜0.05)含量上升;其中GBNT低劑量組降脂效果就與GBN相當，高劑量組降脂效果優(yōu)于GBN組，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);同時GBNT高劑量組調(diào)節(jié)TC，TG，HDL-C比辛伐他丁陽性組更好，無統(tǒng)計學意義，但有一定趨勢，見表1。

表1 GBNT對大鼠血脂TC，TG，LDL-C，HDL-C含量的影響(±s)

表1 GBNT對大鼠血脂TC，TG，LDL-C，HDL-C含量的影響(±s)

注:aa P ＜0.01 vs正常組;b P ＜0.05，bb P ＜0.01 vs模型組;c P ＜0.05 vs GBN 組。

組別 劑量/mg·kg－1·d－1 TC/mmol·L －1 TG/mmol·L－1 LDL-C/mmol·L －1 HDL-C/mmol·L －1正常組 —1.96 ±0.43 0.95 ±0.25 1.42 ±0.33 0.62 ±0.13模型組 — 12.33 ±2.32aa 2.46±0.77aa 9.38±2.02aa 0.19 ±0.04aa陽性組 10 5.83 ±1.79bb 2.07 ±0.82 5.86 ±1.27bb 0.23 ±0.05b GBN 組 10 8.02 ±2.23bb 1.42 ±0.56bb 5.40 ±1.13bb 0.48 ±0.13bb GBNT 低劑量組 5 9.26 ±2.16b 1.95 ±0.60b 6.22 ±1.46b 0.45 ±0.09bb GBNT 高劑量組 10 7.14 ±1.96bb 1.31 ±0.34bb 5.08 ±1.29bb，c 0.62 ±0.15bb，c

3.2 病理學檢測GBNT對高血脂模型大鼠肝組織的保護作用 正常組肝組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞形狀較為一致，呈多邊形，未見脂肪病變(見圖2A);模型組肝細胞數(shù)目減少，形態(tài)各異，排列紊亂，體積變大，細胞間隙出現(xiàn)空泡，發(fā)生脂肪變性，并有大量炎性細胞浸潤(見圖2B);辛伐他汀組肝臟有水腫表現(xiàn)，出現(xiàn)一些空泡，有脂肪顆粒變性，但與模型組相比較，脂肪變性有所改善，肝損傷有所恢復(見圖2C)。GBN組及GBNT低劑量組顯示出肝細胞有稍微空泡現(xiàn)象，有輕度肝細胞脂肪變性，無水腫表象，較模型組有所改善(見圖2D，見圖2E);GBNT高劑量組可以觀察到肝細胞腫脹、脂肪變性的程度較之模型組均很大改善，肝細胞數(shù)目增多，結(jié)果也較為完整，趨于正常細胞(見圖2F)，其恢復程度優(yōu)于GBN組。

3.3 GBNT對高血脂模型大鼠肝臟脂質(zhì)關(guān)鍵代謝酶及LDLR含量的影響 如圖3所示，相對于正常組，模型組中LCAT，LDLR，CYP7A1表達量皆下降，辛伐他汀陽性組、GBN組、GBNT低、高劑量組皆能極顯著的提高LCAT，LDLR，CYP7A1表達量;其中GBNT低劑量組提高LCAT，CYP7A1表達與GBN組相當，在提高LDLR表達量上優(yōu)于GBN組;GBNT高劑量組皆優(yōu)于GBN組和陽性組;說明GBNT組在調(diào)節(jié)高脂血模型大鼠肝臟脂質(zhì)關(guān)鍵代謝酶更具優(yōu)勢。

4 討論

高脂血癥也可以稱之為血脂代謝紊亂征，高含量血脂可使肝臟成為一個油庫，經(jīng)血液循環(huán)后，致使血液凝稠，產(chǎn)生血稠，阻塞血管壁，導致冠心病，心肌梗死等心腦血管病的產(chǎn)生，而且發(fā)病年齡逐年提前，影響人們生活質(zhì)量。從中藥材中尋找有效單體成分及其衍生物進行調(diào)血脂已成為熱點，并且已有報道胡椒堿的衍生物中GBN具有預防小鼠酒精性脂肪肝作用，但有一定毒性且藥效不顯著［5－6］，因此本課題組在GBN基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)改造獲得其衍生物GBNT，并發(fā)現(xiàn)其具有顯著調(diào)血脂作用。

正常生理狀態(tài)下，血脂處于穩(wěn)態(tài)，當發(fā)生異常時，TC會沉淀在血管壁上，TG會促進凝血異常，產(chǎn)生血栓，導致動脈粥樣硬化，甚至是冠心病;LDL-C參與TC的運輸，從肝臟中運往肝外組織中，過高的話，也會沉淀于血管壁上，呈現(xiàn)粥樣化，導致動脈粥樣硬化。HDL-C可以把肝外組織中的TC運到肝臟中進行分解，代謝為膽汁酸排除體外，當其含量降低的時候，會導致血漿中膽固醇發(fā)生聚集，導致血栓或動脈粥樣硬化。因此調(diào)節(jié)血脂含量有助于降低動脈粥樣硬化等疾病。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飼料飼養(yǎng)可使大鼠血清 TC，TG，LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量下降，說明高脂血癥模型大鼠建立成功，與文獻報道一致［7－8］;通過給藥發(fā)現(xiàn)，GBN組，辛伐他汀陽性組和GBNT組都能抑制此變化，其中GBNT低劑量組和GBN組改善程度一致，高劑量組效果優(yōu)于GBN組。

肝臟是膽固醇生成的主要場所，當血脂含量升高，容易誘發(fā)肝細胞腫脹“變性”壞死，造成肝細胞損害。高血脂模型組中，肝細胞發(fā)生脂肪變性、腫脹，肝細胞胞漿疏松化，嚴重者呈氣球樣變，與陳梅霞［7］，Liu［8］等學者報道基本一致，而不管是陽性對照組還是GBNT治療組都一定程度上減輕肝細胞腫脹，緩解肝臟脂肪病變等受損癥狀，但GBNT使肝組織恢復程度更好，更具優(yōu)勢。

從膳食或者肝臟中獲得的大部分LDL-C能特異性結(jié)合LDLR，胞飲進入溶酶體降解，保持較正常水平，因此LDLR在一定程度上能夠反映血液中膽固醇的含量［9］。Bell［10］，Pauta［11］等學者報道 LDLR－/－小鼠可以作為高血脂模型小鼠，進一步說明LDLR改善高血脂癥中的重要性。正如 Dong［12］，Zhang［13］等學者闡述，高脂血模型組LDLR表達量下降，經(jīng)8周連續(xù)給藥后發(fā)現(xiàn)，GBNT低、高劑量組皆能上調(diào)LDLR表達，效果皆優(yōu)于GBN組。

LCAT是促進HDL-C運轉(zhuǎn)肝外游離膽固醇到肝臟中進行分解代謝的關(guān)鍵酶，從而維持機體膽固醇穩(wěn)態(tài)，避免動脈粥樣硬化等疾病的產(chǎn)生。一定程度上也說明 LCAT活性決定了 HDL-C生成量［8，14］。CYP7A1是膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶，其活性的提高可以促進肝臟中TC分解成膽汁酸，排除體外，機體內(nèi)50%左右的 TC的清除都依賴于CYP7A1的活性［15］。長期攝入高脂飼料會使LCAT［13，16］，CYP7A1［2，17］表達量下降，通過給藥發(fā)現(xiàn)，GBNT低、高劑量組皆能上調(diào)LDLR、CYP7A1表達，其中低劑量組與GBN治療效果相當，高劑量組療效更好。

從而得出GBNT可以調(diào)節(jié)高血脂模型大鼠血脂水平，恢復肝功能，是通過提高LCAT和CYP7A1表達，促進HDL-C生成，達到清除TC，TG，LDL-C的目的，但更具體機制還有待進一步探討。

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