復(fù)方二黃顆粒對腎衰大鼠腎臟纖維化的抑制作用

潘卉萱，劉建社，張 春，黃 杰

(1.安徽省立醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230001;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢 430022)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是危害人類健康的危重病之一，隨病程進展，建存的腎單位發(fā)生代償性增生，而這種代償性機制可導(dǎo)致腎小球進一步硬化、腎小管間質(zhì)的損傷，腎單位進一步減少，最終進展為慢性腎衰竭。目前對于慢性腎衰竭的療法除營養(yǎng)療法、替代療法、及腎臟移植等治療方法外，尚無其它特效的治療方法。替代療法如血液透析、腹膜透析等方法均不能改善腎組織的病理損害，且有不同程度的副作用，腎移植又存在著腎源缺乏和排斥反應(yīng)等缺陷;因此深入研究腎間質(zhì)纖維化的機制，控制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展對延緩腎臟疾病的進展至關(guān)重要。中醫(yī)藥治療類似腎炎病證的歷史悠久，可改善腎組織血液循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，延緩慢性腎臟疾病的進程，在改善慢性腎臟疾病進展方面有一定優(yōu)勢。復(fù)方二黃顆粒是有大黃、黃芪、水蛭等組方而成的復(fù)方中藥顆粒劑，具有益腎、活血化瘀、補氣、扶正祛濁的功效。本實驗通過觀察復(fù)方二黃顆粒劑對腎大部切除腎衰大鼠的腎臟病理的影響，并采用免疫組化法觀察腎組織中TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、FN(纖維連接蛋白)、α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)的表達變化。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠30只，10～12周齡，體重(250±20)g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號:scxk(鄂)2004－2007，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物 復(fù)方二黃顆粒劑由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院研制生產(chǎn)，批號20051206。

1.3 實驗試劑 兔抗鼠FN的多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1的多克隆抗體(滴度為 1∶50)、兔抗鼠 α-SMA的多克隆抗體、SP免疫試劑盒、DAB試劑盒(購于博士德公司)。

1.4 實驗儀器 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院千屏HPIAS－2000型圖像儀。

2 實驗方法

2.1 模型制備［1－2］手術(shù)組大鼠予用3%戊巴比妥鈉45 mg·kg－1，經(jīng)腹腔注射麻醉后，俯臥固定于溫暖手術(shù)臺上，剪毛，從距左脊肋骨1.5 cm處斜向外下方切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎包膜及脂肪后，用絲線離斷結(jié)扎上下級腎組織各約1/3，出血明顯者用明膠海綿壓迫止血片刻，復(fù)位腎臟，腹腔注射青霉素每千克72萬單位，逐層縫合。1周后同樣方式切除整個右腎，兩次手術(shù)共切除5/6腎臟。假手術(shù)組麻醉后切開皮膚及肌肉層，僅分離腎臟包膜，不切除腎臟，手術(shù)后，腹腔注射青霉素，逐層縫合。先行切除左腎的2/3，1周后同樣方式切除整個右腎，兩次手術(shù)共切除5/6腎臟。假手術(shù)組10只僅切開皮膚及肌肉層，僅分離腎臟包膜，不切除腎臟。

2.2 實驗分組 實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型對照組和藥物治療組，每組各10只，假手術(shù)組因麻醉意外死亡1只。根據(jù)藥物臨床用量，計算［3］治療組予以復(fù)方二黃顆粒按3.13 g·kg－1灌胃給藥;假手術(shù)組和模型對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標 在藥物灌胃第8周后處死大鼠。取各組大鼠部分腎組織，于光鏡下觀察腎組織的病理變化;對上述組織切片進行 TGF-β1、FN、α-SMA免疫組化染色。

2.4 結(jié)果分析 結(jié)果采用華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院千屏HPIAS－2000型圖像分析軟件對腎組織免疫組化結(jié)果進行半定量分析，根據(jù)陽性面積占整個測量面積的百分比，計算出百分率。計算腎組織著色面積與面積的比值。腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)病變指數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后，按連續(xù)變量處理。連續(xù)變量采用(±s)表示，三組定量數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析的方法;三組之間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD-t);計數(shù)資料采用卡方檢驗。P ＜0.05，為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 實驗期間，假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)機警，反應(yīng)快，皮毛致密、整齊而有光澤，生長、進食及活動情況均無明顯異常;腎大部切除組明顯營養(yǎng)不良，精神萎靡，活動遲緩，食欲不振，皮毛蓬松、枯槁無光澤，治療組大鼠與假手術(shù)組大鼠一般表現(xiàn)無太大差別，只是皮毛干燥無光，活動慢。

3.2 病理改變

3.2.1 雙腎的大體解剖 正常組:雙腎成蠶豆樣外觀，無腫大，顏色紅褐色質(zhì)地堅實有光澤;切面皮質(zhì)紅褐色，髓質(zhì)淺紅色，皮、髓質(zhì)界線清晰;包膜結(jié)合緊，不易剝離。其它兩組與正常組相比，大鼠殘腎代償性肥大，腎臟腫脹、體積增大，呈灰褐色，缺乏光澤，表面有多數(shù)隆起，和周圍組織黏連;切面皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界不清。治療組大鼠腎臟較模型對照組大鼠腎臟顏色稍紅潤，腫脹相對輕，質(zhì)地稍堅實。

3.2.2 顯微鏡觀察腎臟病理改變 假手術(shù)組腎小球、腎小管及間質(zhì)無明顯改變，排列分布及形態(tài)均正常。模型對照組大鼠腎小球大小極不一致，大多數(shù)腎小球腫大，包曼囊內(nèi)有多少不等的滲出物，毛細血管球內(nèi)有糖原(PAS)染色紅染物質(zhì)明顯增多沉積于系膜和毛細血管周圍。腎小球有核細胞數(shù)增多，以系膜細胞、內(nèi)皮細胞和足細胞增多為主。系膜基質(zhì)增生。腎小球呈局灶節(jié)段性硬化，腎小管上皮細胞渾濁腫脹，部分小管萎縮、壞死，有管型形成，管腔閉塞或擴張，被纖維組織所取代。腎間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)纖維組織增生，面積增寬。

與假手術(shù)組比較，模型對照組的腎小球積分及腎小管間質(zhì)積分均顯著增高 (P＜0.01);與模型對照組比較，復(fù)方二黃顆粒劑可以降低腎小球積分，明顯改善降低腎小管間質(zhì)積分(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠的病理積分(±s)

表1 各組大鼠的病理積分(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與模型對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 。

組別 n 腎小球積分 腎小管間質(zhì)積分假手術(shù)組9 0.18 ±0.09 0.35 ±0.18模型對照組 10 0.82±0.34△ 1.32±0.41△治療組 10 0.40±0.51＊＊ 0.64±0.37*

3.2.3 復(fù)方二黃顆粒劑對腎組織 TGF-β1、FN、α-SMA表達的影響 假手術(shù)組中，TGF-β1的陽性表達僅在少數(shù)腎小管主要在上皮細胞內(nèi)有微量表達，以胞漿著色為主，腎小球有少量表達。模型對照組TGF-β1主要表達于腎小球基底膜和臟層上皮細胞，萎縮或擴張的腎小管上皮細胞，尤其在腎間質(zhì)有單核細胞浸潤處的遠端和近端腎小管上皮細胞內(nèi);部分內(nèi)皮細胞和系膜區(qū)也可見少量陽性表達。

假手術(shù)組中，F(xiàn)N僅少量表達于腎間質(zhì)基質(zhì)及腎小球中，主要表現(xiàn)為系膜基質(zhì)、腎小管基底膜出現(xiàn)極少量棕黃色顆粒。而模型對照組中，F(xiàn)N在系膜基質(zhì)、腎小管上皮細胞基底部、腎小管間質(zhì)表現(xiàn)出強陽性表達，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒。

假手術(shù)組中，α-SMA僅在血管平滑肌細胞呈陽性表達，腎小球、腎小管及間質(zhì)偶見陽性表達;模型對照組中，α-SMA表達主要在皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界處的腎小管及間質(zhì)區(qū)的細胞漿，部分腎小管上皮細胞及其周圍間質(zhì)區(qū)表達明顯，且與局部間質(zhì)增寬及腎小管病變程度一致;在腎小球內(nèi)可見少量表達，以腎小球血管極多見。

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腎組織中TGF-β1、FN、α-SMA 的表達顯著增強(P ＜0.01);與模型對照組比較，治療組大鼠腎組織中 TGF-β1、FN、α-SMA的表達顯著降低 (P＜0.01)。見表2、圖2～4。

表2 各組大鼠腎組織免疫組化檢測結(jié)果比較(±s)/%

表2 各組大鼠腎組織免疫組化檢測結(jié)果比較(±s)/%

注:與假手術(shù)組比較，△P ＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.01。

組別 n TGF-β1 FN α-SMA假手術(shù)組9 1.78 ±0.43 1.17 ±0.34 0.78 ±0.41模型對照組 10 9.12 ±0.71△ 9.35 ±1.52△ 10.65 ±1.54△治療組 10 4.65 ±0.57* 5.47 ±0.81* 6.22 ±0.63*

4 討論

醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰竭最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，促使CKD進展的機制眾多，腎單位的高濾過、高代謝、腎組織上皮細胞表型轉(zhuǎn)分化、細胞因子過度分泌、氧化應(yīng)激等因素均可加重腎損害，并且，各種因素互為因果、相互影響形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。在復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)路中，TGF-β1是最關(guān)鍵的促纖維化生長因子，它可刺激膠原、纖維連接蛋白(FN)、蛋白多糖的表達，促進ECM的產(chǎn)生同時抑制其的降解。同時，許多過度表達的細胞因子都通過TGF-β1介導(dǎo)膠原沉積引起腎纖維化［4－6］。FN是ECM成分中變化最早、最敏感的促腎小球硬化成分，其合成增加在一定程度上代表了ECM的過度積聚。同時FN也是一種重要的調(diào)理介質(zhì)，局部FN和膠原的堆積又促進成纖維細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化及腎臟纖維化的形成［7－8］。α-SMA是多種腎臟固有細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的標志性蛋白。正常腎臟組織中，僅血管平滑肌細胞強陽性表達α-SMA，其它腎臟固有細胞通常不明顯表達α-SMA;病理狀態(tài)下，腎組織出現(xiàn)病理損傷后α-SMA表達上調(diào)，導(dǎo)致腎臟固有細胞被激活出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化，表明腎臟固有細胞由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖表型或分泌表型，腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)成纖維細胞等表達α-SMA標志著它們被激活和異常增殖，具有肌成纖維細胞的特征，即發(fā)生了細胞表型轉(zhuǎn)化;同時，轉(zhuǎn)分化的細胞又主動合成和分秘細胞外基質(zhì)(ECM)，表達并自分泌多種炎癥介質(zhì)，促進腎小球硬化、間質(zhì)纖維化［9］。

中醫(yī)中藥是我國治療腎臟疾病的特色，中醫(yī)學(xué)認為慢性腎衰竭是病位以腎為主并累及多個臟腑，其基本病機是本虛標實;本虛以腎元虧虛為主，標實為水氣、濕濁、濕熱、血瘀、肝風(fēng)之證，目前許多中醫(yī)研究表明瘀血、濁毒、濕熱、水濕都參與了疾病的全過程。中醫(yī)的“血瘀”涵蓋了腎小球血管病變、基質(zhì)增多、固有細胞轉(zhuǎn)分化、腎小管間質(zhì)纖維化等病理變化。而活血和絡(luò)、泄?jié)峤舛尽⑶謇麧駸岬确椒ㄖ委熅行?。?fù)方二黃顆粒根據(jù)中醫(yī)對慢性腎衰竭“虛、瘀、毒、濁”組方，主要由大黃、黃芪、水蛭等組成。大黃是掌葉大黃、藥用大黃、唐古特大黃的干燥根或根莖，具有降泄、排濁毒、祛瘀生新等作用。大黃可增加氮質(zhì)從腸道排出，減輕患者的氮質(zhì)血癥，并具有改善患者血液的高凝狀態(tài)、抑制腎臟固有細胞增殖、減少腎組織ECM聚積、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂等作用［10－12］。黃芪是內(nèi)蒙黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，含有黃芪皂甙、黃芪總黃酮、黃芪多糖、多種氨基酸等有效成分，具有益氣固本、利尿消腫等功效。黃芪具有雙向免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能，還可改善腎臟微循環(huán)、促進腎組織對有害抗原的清除、促進腎小球基底膜的修復(fù)、減輕腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制細胞凋亡，從而保護腎功能［12－14］。水蛭具有破血，逐瘀，利水功效，其含有水蛭素、肝素和抗血栓素等活性成分，具有抗凝、抗血栓形成、降低血液黏稠度、改變血液流變學(xué)的作用，且水蛭素還可減輕腎小球系膜細胞增生、減少纖維蛋白沉積，從而可延緩腎衰竭的進展［15］。

本實驗觀察到，復(fù)方二黃顆粒改善了腎大部切除后慢性腎衰竭大鼠的生活狀態(tài)及殘腎的腎臟病理改變，降低了殘腎組織中 TGF-β1、FN、α-SMA的表達，減少ECM的聚集，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，延緩慢性腎衰竭的進展，對慢性腎衰竭大鼠腎臟具有一定的保護作用。其作用機制可能與部分下調(diào)腎臟下調(diào)TGF-β1、FN、α-SMA的表達，減少細胞外基質(zhì)的過度沉積，減少腎臟固有細胞的轉(zhuǎn)分化，減少腎小球內(nèi)細胞增生等作用有關(guān)。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果顯示，復(fù)方二黃顆?？梢灶A(yù)防性阻止殘余腎組織的代償性增生和肥大，延緩腎小球硬化、抑制腎臟纖維化。對臨床上中西藥聯(lián)合治療延緩慢性衰竭進展具有一定的參考意義。

［1］Kennedy DJ，Elkareh J，Shidyak A，et al.Partial nephrectomy as a model for uremic cardiomyopathy in the mouse［J］.Am JPhysiol Renal Physiol，2008，294(2):450 －454.

［2］王瑞強，王 毅，蒲娟娟，等.大鼠慢性腎衰竭模型的建立及體會［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2011，32(19):20 －23.

［3］章元沛.藥理學(xué)實驗［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1985:238－239.

［4］Yin JP，F(xiàn)u P，Xie XS，et al.Effects of piperazine ferulate on connective tissue growth factor and extracellular matrix in TGF-beta1 induced mesangial cells［J］.Sichuan University(Medical Science Edition)，2008，39(5):732 －735.

［5］Yanagita M.Inhibitors/antagonists of the TGF-β system in kidney fibrosis［J］.Nephrol Dial Transplant，2012，27(10):3686 －3691.

［6］López-Hernández FJ，López-Novoa JM.Role of TGF-β in chronic kidney disease an integration of tubular，glomerular and vascular effects［J］.Cell Tissue Res，2012，347(1):141 － 154.

［7］Boor P，Ostendorf T，F(xiàn)loege J.Renal fibrosis:novel insights into mechanisms and therapeutic targets［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6(11):643－656.

［8］Mao Y，Schwarzbauer JE.Fibronetin fibrillogencsis，a cell-mediated matrix assembly process［J］.Matrix Biology，2005，24(6):389－399.

［9］侯魯魯，王秋月，馬東蔚，等.高糖誘導(dǎo)下人腎小球系膜細胞AMPK、MPO、α-SMA 的變化以及 α-硫辛酸的干預(yù)作用［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(8):17 －21.

［10］沈建明，鄧妍妍，田少江，等.大黃減輕維持性血液透析患者靜脈鐵劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和微炎癥反應(yīng)［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(12):1465－1467.

［11］戴 潔.大黃藥理研究與臨床應(yīng)用［J］.天津藥學(xué)，2011，23(4):67－69.

［12］陳 晶，張博華.黃芪、大黃的抗腎纖維化作用研究進展［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(6):101 －104.

［13］段賢春，方朝暉，姚先梅，等.中藥黃芪治療糖尿病及糖尿病腎病研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(9):1592 －1594.

［14］傅曉駿，熊榮兵.黃芪水蛭制劑對糖尿病腎病大鼠腎組織中C-IV、FN及IL-1β表達的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(2):305 －308.

［15］張和韡，王麗萍.水蛭素的研究進展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(1):76 －78.