LC-MS/MS檢測(cè)生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

翟金曉，劉偉

（1．司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

LC-MS/MS檢測(cè)生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

翟金曉1，2，劉偉1

（1．司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123）

目的建立生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法0.4mL血液、尿液或0.4g肝組織加入內(nèi)標(biāo)混勻后用乙酸乙酯進(jìn)行提取，提取物經(jīng)Allure PFP Propyl柱（100mm×2.1mm，5μm）分離，以甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液梯度洗脫，采用電噴霧正離子化（ESI+）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)雷公藤甲素和雷公藤酯甲。結(jié)果各生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性良好（r>0.9950），檢出限均為2ng/mL或2ng/g，回收率為61.08%～102.98%，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于12.58%，準(zhǔn)確度為90.61%～105.80%。結(jié)論所建方法簡(jiǎn)便、選擇性好，適用于同時(shí)分析各種生物檢材中的雷公藤甲素和雷公藤酯甲，為雷公藤中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定和臨床診治提供技術(shù)保障。

法醫(yī)毒理學(xué)；色譜法，液相；串聯(lián)質(zhì)譜法；雷公藤甲素；雷公藤酯甲；生物檢材

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）為衛(wèi)矛科（Celastraocse）雷公藤屬植物，是我國(guó)重要的天然藥物資源，主要分布在長(zhǎng)江以南[1]。雷公藤也是近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)發(fā)生中毒事件最多的中草藥之一。雷公藤全株均有不同程度的毒性，嫩芽及葉最大，木質(zhì)部最小[2]。雷公藤甲素，又稱雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤內(nèi)酯，是從雷公藤中分離的具有松香烷結(jié)構(gòu)的三環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，是雷公藤藥材及其制劑的主要有效成分之一，也是引起毒副作用的主要成分[3-4]。我國(guó)臨床上應(yīng)用的各種雷公藤制劑多數(shù)以其作為主要活性成分。生藥中也以雷公藤甲素的含量多少來(lái)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的好壞[5]。雷公藤酯甲屬于三萜類成分，具有較強(qiáng)的抗感染及免疫抑制作用，同時(shí)具有明顯的毒副作用，主要表現(xiàn)在消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓及血液

系統(tǒng)等[6]。雷公藤多苷片的主要成分為雷公藤酯甲，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定是以雷公藤酯甲作為對(duì)照，采用薄層掃描法進(jìn)行測(cè)定[7]。雷公藤的治療劑量與中毒劑量非常接近，療效與劑量呈明顯的量效關(guān)系[8]。雷公藤嫩葉7個(gè)尖（約12 g）即可致死，服其葉2～3片可中毒，根的韌皮部30～60 g可致死，一般中毒后24 h死亡，最多不超過(guò)4d[9]，因攝入雷公藤中毒及死亡的案（?。├龝r(shí)有報(bào)道[10-11]。

對(duì)雷公藤及雷公藤制劑的成分、檢測(cè)及提取方法已有了廣泛的研究[12-14]。目前對(duì)體外雷公藤甲素或雷公藤酯甲的檢測(cè)方法應(yīng)用最為廣泛的是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15-16]，對(duì)于體內(nèi)雷公藤甲素的檢測(cè)方法主要是液相色譜-大氣壓化學(xué)源-質(zhì)譜法（liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry，LC-APCI-MS）[17-18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），后者包括LC-APCI-MS/MS[13]和LC-ESI-MS/MS[14，19]。本研究旨在建立液液提取技術(shù)和LC-ESI-MS/MS同時(shí)檢測(cè)血液、尿液及肝組織中痕量雷公藤甲素和雷公藤酯甲的分析體系，以簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠地滿足雷公藤中毒鑒定的需要，為雷公藤中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定、臨床診斷及救治提供科學(xué)的手段，并對(duì)此方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

API 4000 Q trap四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司），配AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；XW-80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；MD200-2氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；TDZ4-WS離心機(jī)（賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；MINSPIN高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.1.2 藥品與試劑

對(duì)照品雷公藤甲素、雷公藤酯甲（純度≥98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；內(nèi)標(biāo)納洛酮（純度≥98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

乙腈（HPLC級(jí)）、甲醇（HPLC級(jí)）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，乙酸銨（HPLC級(jí)）購(gòu)自Fluka公司，甲酸（優(yōu)級(jí)純）、乙酸乙酯（分析純）和乙醚（分析純）均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，超純水由Milli-Q（Millopore純水系統(tǒng)）制得。

空白全血（經(jīng)肝素抗凝）、空白尿液均由近期未服用過(guò)目標(biāo)藥物的健康志愿者提供，空白肝為市售新鮮豬肝。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

對(duì)照品溶液：分別精密稱取對(duì)照品雷公藤甲素及雷公藤酯甲5mg于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度均為1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，密封儲(chǔ)存于-18℃冰箱中，待用。實(shí)驗(yàn)中所用的其他濃度的對(duì)照品溶液均由上述對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋而得。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取對(duì)照品納洛酮10mg于10mL容量瓶中，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的納洛酮儲(chǔ)備液。取納洛酮儲(chǔ)備液適量用甲醇稀釋得2μg/mL的內(nèi)標(biāo)甲醇工作液。

20 mmol/L乙酸銨溶液：稱取乙酸銨1.54 g置于1000mL容量瓶中，加入水溶解定容。

混合溶液：V（甲醇）∶V（20mmol/L乙酸銨溶液）= 33∶67。

1.2.2 樣品前處理

取血液或尿液0.4mL，加入2μg/mL納洛酮內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，渦旋混合1 min，用3 mL乙酸乙酯提取，渦旋混合3min，以1 650×g離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，在60℃氮吹儀上吹干，殘留物用80μL混合溶液復(fù)溶，供LC-MS/MS分析。

將生物組織研碎，稱取0.4 g，加入2 μg/mL納洛酮內(nèi)標(biāo)工作液10μL，渦旋混合1min，用3mL乙酸乙酯提取，渦旋混合3 min，1 650×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，在60℃氮吹儀上吹干，殘留物用80μL混合溶液復(fù)溶，復(fù)溶液置于微量離心管中-20℃冷凍過(guò)夜，次日以1 650×g離心3 min，取上清液于進(jìn)樣小瓶中，供LC-MS/MS分析。

1.2.3 儀器條件

（1）液相條件。色譜柱：Allure PFP Propyl（100mm× 2.1 mm，5 μm），前接Phenomenex保護(hù)柱。流動(dòng)相：A（甲醇）-B（20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液），洗脫程序?yàn)?～3min，V（A）∶V（B）=33∶67，流速為0.2mL/min；3～ 7min，V（A）∶V（B）=5∶95，流速為0.3mL/min；7～10min，V（A）∶V（B）=33∶67，流速為0.3mL/min。柱溫：室溫。進(jìn)樣量：10μL。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧正離子化（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)。離子源電壓（IS）：5 500 V。氣簾氣（CUR）：206.8kPa。霧化氣（GS1）：206.8kPa。輔助氣2（GS2）：413.7kPa。離子源溫度（TEM）：500℃。

按上述條件，通過(guò)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，分別得到由雷公藤甲素、雷公藤酯甲和內(nèi)標(biāo)納洛酮的母離子與其兩個(gè)子離子組成的兩對(duì)母離子/子離子對(duì)。各離子對(duì)的駐留時(shí)間均為150ms。定性分析以各化合物的兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行，并以第一對(duì)離子對(duì)進(jìn)行定量分析。定性、定量離子對(duì)、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）和保留時(shí)間（tR）見表1。

表1 雷公藤甲素和雷公藤酯甲與內(nèi)標(biāo)納洛酮的MS/MS參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 方法的選擇性

對(duì)10份不同來(lái)源的空白血液、空白尿液及空白肝按照“1.2.2樣品前處理”進(jìn)行操作，按“1.2.3儀器條件”進(jìn)行分析，并與相同空白基質(zhì)中添加兩種目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的添加樣品比較。結(jié)果表明，空白樣品在目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)出峰時(shí)間上無(wú)響應(yīng)，說(shuō)明空白內(nèi)源性基質(zhì)無(wú)干擾，方法的選擇性良好?？瞻籽杭翱瞻籽褐刑砑幽繕?biāo)物的MRM色譜圖見圖1。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，加入內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，加入雷公藤甲素和雷公藤酯甲對(duì)照品溶液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、80、100、200、400、500ng/mL（g）的雷公藤甲素和雷公藤酯甲血液、尿液和肝的樣品，其中將10、100、400 ng/mL（g）作為質(zhì)控樣品，質(zhì)控樣品每一濃度6份，其余樣品每一濃度為2份，以前述方法進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定。分別以雷公藤甲素和雷公藤酯甲的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（y）對(duì)雷公藤甲素和雷公藤酯甲濃度（x，ng/mL或ng/g）作線性回歸，得到血液、尿液和肝的線性方程及相關(guān)系數(shù)，并以信噪比S/N≥3的濃度得到檢出限（LOD），S/N≥10的濃度得到定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

圖1 空白血液及添加血液的MRM色譜圖

表2 血液、尿液及肝中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQ

2.3 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，同上法配制成含雷公藤甲素和雷公藤酯甲低、中、高3個(gè)濃度［10、100、400 ng/mL（ng/g）］的質(zhì)控樣品各6份，按照前述方法進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣分析，所得各目標(biāo)物的峰面積為A1；相同的空白基質(zhì)同法處理后，在吹干的殘余物中加入一定量濃度的對(duì)照品溶液配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，定容，進(jìn)樣分析，所得目標(biāo)物的峰面積為A2；提取回收率=A1/A2×100%；另取相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，吹干后用混合溶液定容后進(jìn)樣分析，測(cè)得目標(biāo)物的峰面積為A3，基質(zhì)效應(yīng)= A2/A3×100%，結(jié)果見表3。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，同上法配制成含雷公藤甲素和雷公藤酯甲低、中、高3個(gè)濃度［10、100、400ng/mL（ng/g）］的質(zhì)控樣品各6份，按照前述方法進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣分析。以當(dāng)日工作曲線計(jì)算各樣品中的雷公藤甲素和雷

公藤酯甲的含量，求得6份質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度（RSD）。同法連續(xù)測(cè)定4 d，計(jì)算日間精密度（RSD），結(jié)果見表3。

由表3中可見，各樣品中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的日內(nèi)精密度和日間精密度均在12.58%以內(nèi)，準(zhǔn)確度為90.61%～105.80%，提取回收率為61.08%～102.98%，基質(zhì)效應(yīng)為76.67%～105.96%，可以滿足生物檢材中毒物分析的要求。

表3 各檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（%）

2.5 穩(wěn)定性

取空白血液0.4mL若干份，同上法配制雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯甲低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（10、100、400ng/mL）的質(zhì)控樣品，分別考察4種不同保存條件下［室溫下放置24 h、3個(gè)反復(fù)凍融循環(huán)（-20℃到室溫）、經(jīng)樣品前處理后的樣品提取物室溫放置24 h、-20℃條件下冷凍保存1個(gè)月］樣品的穩(wěn)定性，每種條件下每個(gè)濃度樣品各6份。

結(jié)果顯示，血液樣品在室溫下放置24h、-20℃反復(fù)凍融、處理后的樣品提取物室溫放置24 h以及在-20℃條件下冷凍保存1個(gè)月的4種條件下，樣品的相對(duì)偏差均小于14.60%，表明血液樣品在上述保存條件下的穩(wěn)定性較為良好。

3 討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

一般而言，生物樣品是不能直接進(jìn)樣分析的，必須經(jīng)過(guò)一定的前處理步驟來(lái)去除樣品中的脂質(zhì)、內(nèi)源性蛋白等雜質(zhì)成分。樣品前處理是生物樣品分析中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，在LC-MS/MS分析中，常用蛋白沉淀、液液提取、固相萃取等方法對(duì)生物樣品進(jìn)行分離純化。由于雷公藤甲素具有極性小、難溶于水、溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等的化學(xué)性質(zhì)，常用的液液提取法能很好地將其從生物檢材中提取出來(lái)。本研究比較了乙醚、乙酸乙酯兩個(gè)常用的提取溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，雷公藤甲素和雷公藤酯甲的提取回收率比用乙醚時(shí)略高，故本研究選用了以乙酸乙酯為提取溶劑的液液提取前處理方法。結(jié)果表明，以此樣品前處理技術(shù)可以得到較高的靈敏度和提取回收率，且操作簡(jiǎn)單方便，選擇性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。

另一方面，樣品的復(fù)溶溶液會(huì)對(duì)目標(biāo)物在色譜柱中的色譜行為和離子化效率產(chǎn)生影響，為了得到良好的檢測(cè)結(jié)果，本研究分別選用甲醇、乙腈、流動(dòng)相溶液（混合溶液）作為樣品的復(fù)溶溶劑，考察進(jìn)樣后的出峰情況。結(jié)果表明，使用混合溶液作為進(jìn)樣前的復(fù)溶溶劑時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰峰形對(duì)稱，分離度較佳，且兩種物質(zhì)的色譜峰豐度相對(duì)較高。因此本研究選用混合溶液作為樣品的復(fù)溶溶液。

3.2 儀器條件的選擇

3.2.1 色譜柱的選擇

本研究考察了幾種不同填料的色譜柱對(duì)雷公藤甲素和雷公藤酯甲分離效率的影響，發(fā)現(xiàn)Allure Aqueous C18柱（50mm×2.1mm，5μm）及其他規(guī)格的C18柱對(duì)雷公藤甲素和雷公藤酯甲的分離情況不理想，兩種目標(biāo)

物的色譜峰保留時(shí)間很接近，不能使其有效分離，且峰形不理想，這種情況對(duì)定量結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響，而Allure PFP Propyl柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）可使雷公藤甲素和雷公藤酯甲完全分離，且峰形較窄，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，無(wú)生物基質(zhì)的干擾，靈敏度也相對(duì)較高，故本研究選擇Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm，5μm）色譜柱對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇

為達(dá)到最佳的離子化效率，獲得最佳的靈敏度，本研究對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。一般認(rèn)為，在流動(dòng)相中加入緩沖鹽如甲酸銨、乙酸銨等，或加入酸性物質(zhì)如甲酸、乙酸等，可以提高離子化效率，提高靈敏度和改善分離效果。本研究考察了乙腈-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液、甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液三種流動(dòng)相體系作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中存在甲酸時(shí)目標(biāo)物峰形欠佳，而選用甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)，其分離情況相對(duì)較好，且峰型較窄，豐度較高，說(shuō)明在中性條件下，更利于被測(cè)組分離子化和被測(cè)組分色譜峰的分離。而由于雷公藤甲素較難電離，且雷公藤甲素和雷公藤酯甲極性差異較大，選用梯度洗脫更能使兩者都得到較好的分離。

3.2.3 質(zhì)譜母離子、子離子的選擇

分別將雷公藤甲素和雷公藤酯甲的對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇配制成200ng/mL的對(duì)照品溶液，采用電噴霧正離子化（ESI+）模式，通過(guò)直接進(jìn)樣法，優(yōu)化質(zhì)譜條件，從而確定各分析物的母離子質(zhì)量數(shù)，通過(guò)全掃描方式得到各分析物的二級(jí)質(zhì)譜圖。結(jié)果在離子源（ESI+）電離模式下，采用全掃描方式可得到雷公藤甲素和雷公藤酯甲的[M+18]+準(zhǔn)分子離子峰，依次為m/z 378.4、m/z 472.5，以此作為其母離子。在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)豐度較高的子離子與母離子組成兩個(gè)母離子/子離子對(duì)，并優(yōu)化去簇電壓（DP），再采用Product Ion方式對(duì)子離子碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化，使得母離子的強(qiáng)度占最大子離子強(qiáng)度的1/3～1/2時(shí)獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖為最佳，選擇能產(chǎn)生最高豐度子離子的碰撞能量作為該子離子的最佳碰撞能量。最終選定兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行定性分析（雷公藤甲素：378.4→361.2，378.4→145.2；雷公藤酯甲472.5→437.2，472.5→191.4），選其中一對(duì)離子對(duì)（雷公藤甲素：378.4→361.2；雷公藤酯甲472.5→437.2）進(jìn)行定量分析。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

分析方法中為得到良好的定量結(jié)果，一般選擇內(nèi)標(biāo)法定量，由于內(nèi)標(biāo)法定量通過(guò)測(cè)定內(nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算，因而在一定程度上消除了實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所引起的誤差。同位素氘代內(nèi)標(biāo)無(wú)疑是質(zhì)譜定量分析的最佳選擇，由于本研究中沒有商品化的雷公藤甲素和雷公藤酯甲的氘代物質(zhì)，故選用了納洛酮作為內(nèi)標(biāo)。選擇納洛酮作為內(nèi)標(biāo)的原因在于：（1）樣品中不含有此內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；（2）納洛酮色譜峰的保留時(shí)間在兩個(gè)待測(cè)組分之間，三種物質(zhì)分離良好，峰形均佳；（3）納洛酮性質(zhì)穩(wěn)定，在提取溶液中充分溶解且與目標(biāo)物無(wú)化學(xué)反應(yīng)。選擇添加恰當(dāng)質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)物（50 ng/mL），使其峰面積與待測(cè)組分相近。結(jié)果表明，選擇納洛酮作為內(nèi)標(biāo)物對(duì)雷公藤甲素和雷公藤酯甲進(jìn)行定量，獲得了良好的分析結(jié)果。

3.4 結(jié)論

本研究建立了一種經(jīng)液液提取后、運(yùn)用LC-MS/MS檢測(cè)多種生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適用于同時(shí)分析生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲，可為雷公藤中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定和臨床診治提供技術(shù)保障。

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（本文編輯：于笑天）

Determination of Triptolide and Wilforlide A in Biological Samples by LC-MS/MS

ZHAI Jin-xiao1,2,LIU Wei1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China;2.School of Biology and Basic Medical Sciences,Department of Medicine, Soochow University,Suzhou 215123,China）

Objective To determinate triptolide and wilforlide A in biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method and to verify the method.Methods After 0.4mL blood,urine or 0.4 g hepatic tissues with internal standard were extracted by ethyl acetate,they were separated on a Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm,5μm）with a mobile phase of methanol-20mmol/L ammonium acetate using gradient elution.For mass spectrometric detection,electrospray ionization（ESI+）in positive mode was elected and the data was collected using multiple-reaction monitoring（MRM）. Results The linearity was good（r>0.9950）and the limit of detection was 2ng/mL or 2ng/g for triptolide and wilforlide A.The recovery was 61.08%-102.98%.The intra-day and inter-day precision was less than 12.58%for each biological sample,and the accuracy was 90.61%-105.80%.Conclusion This method is simple,convenient and good selective,and could be applied to analysis of triptolide and wilforlide A in different biological samples.And the method may provide technical support for forensic medicine identification,clinical diagnosis and treatment of tripterygium wilfordiiHook.f.poisoning.

forensic toxicology;chromatography,liquid;tandem mass spectrometry;triptolide;wilforlide A;biological samples

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.008

1004-5619（2015）06-0445-05

上海市科委科研項(xiàng)目（072512019）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（14DZ2270800）

翟金曉（1989—），女，碩士，主要從事法醫(yī)毒物學(xué)研究；E-mail：zhaijinxiao@126.com

劉偉，女，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒物學(xué)研究；E-mail：liuw@ssfjd.cn