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    UPLC-IDMS法測(cè)定配方奶粉中的生物素含量

    2015-12-13 07:02:25梁敏慧崔亞娟全霞陳兆天李菁菁
    食品科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:生物素同位素奶粉

    梁敏慧,崔亞娟*,葉 潤,李 全霞,陳兆天,李菁菁,李 東

    (1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124;2.北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

    UPLC-IDMS法測(cè)定配方奶粉中的生物素含量

    梁敏慧1,崔亞娟2,*,葉 潤2,李 全霞2,陳兆天2,李菁菁2,李 東2

    (1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124;2.北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

    建立一種超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定配方奶粉中生物素含量的方法。樣品中加入生物素-D2作為同位素內(nèi)標(biāo),經(jīng)水超聲提取后,以含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,采用電噴霧正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明:生物素在1~50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性范圍內(nèi)對(duì)已知生物素含量樣品3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平的平均回收率為89.6%~93.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%~4.33%。方法檢出限為0.6 μg/100 g,定量限為1.5 μg/100 g,該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),可以滿足配方奶粉中生物素含量的測(cè)定要求。

    生物素;超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜;奶粉

    生物素又叫做VB7,是一種水溶性B族維生素。生物素是構(gòu)成羧化酶的重要輔酶[1],參與人體內(nèi)脂肪、糖類和氨基酸的代謝[2],對(duì)于維持機(jī)體正常生理功能有重要的作用。其長期攝入不足會(huì)導(dǎo)致免疫、代謝、基因表達(dá)方面的疾病[3-7]。配方奶粉是嬰幼兒除母乳外主要的營養(yǎng)來源,因此對(duì)其中生物素的檢測(cè)監(jiān)督是十分必要的。

    目前,配方奶粉中生物素的測(cè)定方法主要是微生物法[8-10]。微生物法也是我國分析嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標(biāo)分析方法,其檢測(cè)靈敏度高,但是實(shí)驗(yàn)周期長、重復(fù)性差,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境有比較嚴(yán)格的要求。其他常用于生物素檢測(cè)的分析方法還包括生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法[1,11-12]等。超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatographyisotope dilution mass spectrometry,UPLC-IDMS)技術(shù)是一種新型的儀器分析手段,它將色譜良好的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性結(jié)合起來,具有靈敏性高、選擇性好、分析速度快并且分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),近年來在食品分析中得到了廣泛的應(yīng)用[13-14]。而同位素稀釋技術(shù)[15-16]通過加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記物,可有效消除基質(zhì)效應(yīng)及處理過程帶來的較大偏差,盡可能保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來,國內(nèi)已有報(bào)道利用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定配方奶粉中的生物素[17-19],但采用同位素稀釋法分析測(cè)定奶粉中生物素含量的方法尚未見報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)采用可以抵消樣品處理過程中損失的同位素稀釋質(zhì)譜法,同時(shí)結(jié)合UPLC-串聯(lián)質(zhì)譜良好的分離能力及高選擇性,對(duì)配方奶粉中的生物素進(jìn)行了定性和定量分析,建立一種結(jié)果準(zhǔn)確、分析速度快、樣品處理簡單的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    配方奶粉樣品(樣品A~E、a~e) 市購。

    生物素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%) 美國Supelco公司;生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%) 美國Iso Sciences公司;乙酸銨、甲酸(均為色譜純) 美國Sigma公司;乙腈(色譜純) 美國Fisher公司;硫酸、鹽酸(均為分析純) 北京化學(xué)試劑廠;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Acquity@UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司;BS224S型分析天平德國Sartorius公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

    生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL):精確稱取生物素1.0 mg,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解至10 mL,搖勻,密封、避光保存。生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL):稱取生物素-D21.0 mg,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解至10 mL,搖勻,密封、避光保存。臨用前根據(jù)需要用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.3.2 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

    根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[20-21]和標(biāo)準(zhǔn)[22]選取奶粉經(jīng)0.5 mol/L硫酸、1.0 mol/L鹽酸溶解后在121 ℃,1 MPa條件下水解30 min和水溶解后超聲10 min作為樣品提取方法,考察不同提取方法的提取效果。并通過實(shí)驗(yàn)比較三氯甲烷、調(diào)pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質(zhì)的效果。

    確定樣品處理方法后稱取奶粉樣品7 g(精確至0.000 1 g)于50 mL錐形瓶中,加入與樣品中生物素含量相近的生物素-D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;瓶中加入30 mL溫水振搖溶解后,超聲提取10 min。冷卻至室溫,用5 mol/L硫酸調(diào)pH值到1.7,再用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值到4.6,溶液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,用水沖洗3 次,合并溶液于容量瓶中,定容混勻后過濾,濾液過0.2 μm聚丙烯濾膜濾膜,待上機(jī)分析。

    1.3.3 色譜條件優(yōu)化

    色譜柱:實(shí)驗(yàn)比較BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Acquity@HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)分離效果的差異;流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相A:含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸銨水溶液;流動(dòng)相B:乙腈。梯度洗脫,洗脫條件見表1。

    表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table1 Elution conditions of mobile phase

    1.3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

    電噴霧離子源正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè);毛細(xì)管電壓3 000 V;離子源溫度150 ℃;去溶劑氣溫度500 ℃;去溶劑氣流速(氮?dú)猓? 000 L/h;碰撞氣流速(氬氣)0.18 mL/min。

    在電噴霧源正離子檢測(cè)方式下,生物素的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+峰。配制0.5 μg/mL的生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液,調(diào)節(jié)各個(gè)參數(shù)得到響應(yīng)較強(qiáng)的[M+H]+母離子峰。然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描,調(diào)節(jié)碰撞能量,選擇響應(yīng)較高的2 個(gè)子離子作為定性定量離子。2 個(gè)離子中響應(yīng)高的作為定量離子,另一個(gè)作為定性離子。優(yōu)化確定適合本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜條件。

    1.3.5 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

    1.3.5.1 線性范圍

    準(zhǔn)確吸取生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,添加與試樣中生物素含量相近的生物素同位素內(nèi)標(biāo)溶液,用水配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、20、30、40、50 ng/mL的生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析,確定生物素的線性范圍。

    1.3.5.2 檢出限與定量限

    選擇木薯淀粉作為空白樣品(經(jīng)測(cè)定不含生物素),對(duì)其進(jìn)行不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn),樣品進(jìn)行前處理后,以RSN為3和RSN為10作為生物素的檢出限和定量限。

    1.3.5.3 精密度與回收率

    向已知生物素含量的奶粉樣品中分別添加3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),各個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次,計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察方法的精密度與回收率。

    1.3.5.4 與微生物方法比對(duì)

    選取5 種市購的配方奶粉(樣品A~E),每種樣品平均分成2 份,一份采用微生物法測(cè)定其中的生物素含量,另一份采用UPLC-IDMS測(cè)定其中的生物素含量,每份平行測(cè)定6 次,計(jì)算奶粉中生物素含量,通過2 種方法結(jié)果的比較驗(yàn)證UPLC-IDMS方法的可行性與準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

    表2 不同前處理方法結(jié)果Table2 Comparison of different sample pretreatment procedures

    不同提取方法的提取效果見表2。結(jié)果顯示,3 種方法最終測(cè)定值并無顯著差異,都可以獲得較好的結(jié)果。但用水超聲提取處理樣品后,儀器峰面積響應(yīng)值要比另外2 種方法高出很多,這可能是由于酸對(duì)生物素及其內(nèi)標(biāo)的離子抑制作用而導(dǎo)致了儀器響應(yīng)值的顯著降低??紤]到分析的準(zhǔn)確性,選擇使用水超聲處理作為樣品的提取方法。

    配方奶粉中含有大量的蛋白質(zhì)存在降低生物素的離子化效率風(fēng)險(xiǎn),從而影響分析的準(zhǔn)確性,并縮短色譜柱的使用壽命[18]。實(shí)驗(yàn)通過比較三氯甲烷、調(diào)pH值、乙腈和高氯酸去除蛋白質(zhì)的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷、調(diào)pH值以及高氯酸法沉淀蛋白效果較好,可以獲得較為澄清的溶液,回收率均為90%以上。但考慮到色譜柱適合的pH值范圍以及不同樣品在水中的pH值差異會(huì)影響生物素在色譜柱上的保留時(shí)間,因此選擇調(diào)pH值法作為去除蛋白質(zhì)的方法。

    2.2 色譜條件優(yōu)化

    實(shí)驗(yàn)中2 種色譜柱的分離效果差異見圖1。C18柱的保留時(shí)間比T3柱提前,2 種柱子對(duì)生物素都有良好的分離效果,但T3柱的響應(yīng)值(6.28×106)要好于C18柱(3.24×106)的響應(yīng)值,因此實(shí)驗(yàn)選擇T3柱。

    2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

    質(zhì)譜條件優(yōu)化后確定的生物素定性和定量離子對(duì)分別為m/z 245.1>97.0和m/z 245.1>227.0,生物素-D2的定性和定量離子對(duì)分別為m/z 247.1>99.0和m/z 247.1>229.0。生物素及其同位素的母離子、定量定性離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)見表3。生物素及其同位素-D2的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖2,子離子掃描圖見圖3。

    表3 生物素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table3 Instrumental parameters of biotin and biotin-D

    圖2 生物素及生物素--DD2的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of biotin and biotin-D2

    圖3 生物素和生物素--DD2的離子掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of biotin and biotin-D2

    2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

    2.4.1 線性范圍

    以生物素與生物素內(nèi)標(biāo)峰面積比(A生物素/A生物素-D2)和同位素質(zhì)量濃度的乘積為 縱坐標(biāo),生物素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖4所示。生物素在1~50 ng/mL范圍內(nèi),線性回歸方程為Y=1.826 97X+ 0.049 075 6,相關(guān)系數(shù)r大于0.999 8,線性關(guān)系良好,十分適合做定量分析。

    圖4 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The calibration curve of biotin

    2.4.2 檢出限與定量限

    以RSN為3作為檢出限,RSN為10作為定量限,得到方法的檢出限為0.4 ng/mL,定量限為1.0 ng/mL。當(dāng)奶粉質(zhì)量為7 g,定容體積為100 mL時(shí),折算成奶粉含量分別為0.6 μg/100 g和1.5 μg/100 g,表明該方法可對(duì)生物素含量較少的奶粉樣品進(jìn)行定性定量分析。

    2.4.3 精密度與回收率

    向奶粉樣品中分別添加3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),各個(gè)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。生物素3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在89.6%~93.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.71%~4.33%,表明該方法比較準(zhǔn)確,適用于奶粉中生物素的定性定量分析。

    表4 生物素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of recovery and relative standard deviation

    2.4.4 與微生物方法的比對(duì)

    微生物法是我國測(cè)定嬰幼兒食品和乳品中生物素的國標(biāo)分析方法。實(shí)驗(yàn)比較了UPLC-IDMS法與微生物法之間的差異來驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性。對(duì)5 種配方奶粉樣品同時(shí)做了2 種方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)結(jié)果見表5。 利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做非參數(shù)Mann-Whitney秩和檢驗(yàn),分析2 種方法測(cè)定結(jié)果之間差異是否顯著:得出P值為0.705(P>0.05),表明2 種方法測(cè)定結(jié)果無顯著差異,證明了實(shí)驗(yàn)建立的方法可以用于配方奶粉中生物素的檢測(cè)。

    表5 微生物法和UPLC-IDMS法對(duì)照實(shí)驗(yàn)Table 5 Comparison of microbiological method and UPLC-IDMS method

    2.5 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

    表6 配方奶粉中生物素UPLC-IDMS測(cè)定結(jié)果Table 6 Analytical results for milk powder samples by UPLC-IDMS

    利用所建立的方法對(duì)市售的5 種配方奶粉(樣品a~e)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次,計(jì)算平均值,結(jié)果見表6??梢钥闯?,5 種配方奶粉中生物素含量均大于8 μg/100 g的,符合國家標(biāo)準(zhǔn)[23]。

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)建立了一種可以快速檢測(cè)配方奶粉中的生物素含量的方法。奶粉中生物素含量較低且基質(zhì)復(fù)雜,通過加入同位素內(nèi)標(biāo)可消除實(shí)驗(yàn)過程中基質(zhì)效應(yīng)的影響和處理過程生物素?fù)p失帶來的偏差,同時(shí)利用質(zhì)譜的高選擇性,簡化了實(shí)驗(yàn)步驟,獲得了穩(wěn)定良好的測(cè)定結(jié)果。該方法操作過程簡單,分析周期短、靈敏度高、重復(fù)性好,適合奶粉中生物素的分析研究,必將受到廣泛的重視。

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    Determination of Biotin in Milk Powder by Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

    LIANG Minhui1, CUI Yajuan2,*, YE Run2, LI Quanxia2, CHEN Zhaotian2, LI Jingjing2, LI Dong2
    (1. College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 2. Beijing Research Institute for Nutritional Resources, Beijing 100069, China)

    An ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS) method has been developed for the determination of biotin in milk powder. After spiking biotin-D2as an internal standard, samples were extracted with water. The mobile phase consisted of 10 mmol/L ammonium acetate with 0.1% f ormic acid and acetonitrile. The biotin was identified under multiple-reaction monitoring (MRM) mode and quantified by an internal standard method. The results showed a good linear calibration in the range of 1–50 ng/mL, the recoveries at three spiked levels and the relative standard deviations were 89.6%–93.1% and 1.71%–4.33%, respectively. T he limit of detection and quantification for biotin were 0.6 μg/100 g and 1.5 μg/100 g, respectively. This method is sensitive, time saving, and accurate for the determination of biotin in milk powder.

    biotin; ultra performance liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry (UPLC-IDMS); milk powder

    TS207.3

    A

    1002-6630(2015)04-0136-05

    10.7506/spkx1002-6630-201504026

    2014-07-02

    北京市科委科技新星計(jì)劃項(xiàng)目(2011059);衛(wèi)生部行業(yè)科研專項(xiàng)(201202012)

    梁敏慧(1992—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称贩治觥-mail:lmh29301126@163.com

    *通信作者:崔亞娟(1979—),女,副研究員,博士,研究方向?yàn)槭称贩治?。E-mail:cuiyj66@163.com

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