駿棗多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

黎云龍，于震宇，郜海燕,*，楊海龍，鄭 銓，李 霞

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；3.阿克蘇職 業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿克蘇 843000；4.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；5.浙江省諸暨市林業(yè)局，浙江 諸暨 311800；6.阿克蘇茂源果業(yè)農(nóng)民專業(yè)合作社，新疆 阿克蘇 843000）

駿棗多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

黎云龍1,2，于震宇3，郜海燕1,2,*，楊海龍4，鄭 銓5，李 霞6

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；3.阿克蘇職 業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿克蘇 843000；4.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；5.浙江省諸暨市林業(yè)局，浙江 諸暨 311800；6.阿克蘇茂源果業(yè)農(nóng)民專業(yè)合作社，新疆 阿克蘇 843000）

研究新疆阿克蘇駿棗多糖的提取工藝條件及其抗氧化活性，采用超聲波預(yù)處理（功率120 W、時(shí)間30 min、溫度60 ℃）輔助熱水提取法提取駿棗多糖，以Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化了提取工藝條件，確定最佳工藝參數(shù)為熱水提取溫度83 ℃、液固比17∶1（mL/g）、提取時(shí)間4 h。此優(yōu)化條件下，駿棗粗多糖得率為9.51%。駿棗粗多糖具有清除自由基的作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，對(duì)2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基和1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基的清除率分別達(dá)到54.29%和51.43%。

響應(yīng)面法；駿棗多糖；超聲波；抗氧化能力

棗是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹（Zizyphus jujuba Mill.）的果實(shí)，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津、調(diào)和藥效和安神鎮(zhèn)痛等功效[1-3]，是傳統(tǒng)中藥和滋補(bǔ)保健佳品。紅棗多糖具有明顯的抗補(bǔ)體活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用，對(duì)提高機(jī)體免疫力具有重要作用[4-6]。近年來，對(duì)紅棗多糖提取工藝的研究日趨增多，包括超聲波[2,7-8]、微波[9]、酶解[10]等輔助提取方法，但將這些輔助提取方法作為預(yù)處理，再結(jié)合傳統(tǒng)熱水浸提的研究鮮有報(bào)道。響應(yīng)面法相比傳統(tǒng)優(yōu)化方法，考慮了試驗(yàn)隨機(jī)誤差，在小區(qū)域內(nèi)用簡(jiǎn)單的一次或二次多項(xiàng)式模型擬合復(fù)雜、未知的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化結(jié)果更為準(zhǔn)確，計(jì)算更為簡(jiǎn)便，越來越多地被應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、生物學(xué)、食品學(xué)、工程學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域[11]。新疆阿克蘇駿棗果大、皮薄肉厚、含糖量高，本實(shí)驗(yàn)以阿克蘇駿棗為研究對(duì)象，采用超聲波輔助提取法預(yù)處理?xiàng)椃郏Y(jié)合熱水提取法提取駿棗多糖，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化駿棗多糖提取工藝，以期在盡量節(jié)約成本的前提下，為阿克蘇駿棗多糖提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗產(chǎn)自新疆阿克蘇。

蒽酮 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FeSO4杭州雙林化工試劑廠；三吡啶三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine，TPTZ）、 1,1-二苯基-2-苦基肼基（1,1-dipheny-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 美國(guó)Sigma公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GBC Cintra 404型紫外-可見分光光度計(jì) 澳大利亞GBC公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將駿棗去核、烘干、粉碎，在索氏抽提器內(nèi)用石油醚回流脫除部分有色物質(zhì)、單糖、雙糖、低聚糖及部分小分子物質(zhì)[12]，真空抽濾后，60 ℃烘干，棗粉備用。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法[13]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

采用超聲波預(yù)處理輔助熱水提取法提取駿棗多糖：超聲波預(yù)處理?xiàng)l件為超聲功率120 W、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度60 ℃，提取溶劑為蒸餾水；之后采用熱水提取法，依次對(duì)提取溫度、液固比和提取時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

固定液固比20∶1（mL/g）、提取時(shí)間3 h，改變提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）提取駿棗多糖，進(jìn)行提取溫度單因素試驗(yàn)；固定提取溫度60℃、提取時(shí)間為4 h，改變液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g））提取駿棗多糖，進(jìn)行液固比單因素試驗(yàn)；固定提取溫度60 ℃、液固比20∶1（mL/g），改變提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）提取駿棗多糖，進(jìn)行提取時(shí)間單因素試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

選擇提取溫度（A）、液固比（B）和提取時(shí)間（C）為主要因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化。

1.3.5 駿棗多糖脫色脫蛋白

將多糖提取液離心15 min，上清液濃縮后，加入95%乙醇沉淀多糖，靜置12 h后抽濾，得到的沉淀依次用95%乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌，洗滌后的沉淀于40 ℃條件下干燥，得到駿棗粗多糖。

將上述得到的駿棗粗多糖加水溶解，60℃條件下用活性炭粉水浴脫色4 h。加入25 mL Sevag試劑（氯仿和正丁醇體積比4∶1），振蕩，靜置分層后棄去下層清液及中間夾雜的變性蛋白，重復(fù)4 次。再用95%乙醇沉淀多糖，4 ℃冰箱靜置12 h后抽濾，依次用95%乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，洗滌后的沉淀于40 ℃條件下真空干燥，得到脫色脫蛋白駿棗多糖。

1.3.6 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.6.1 鐵還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定[14]

取現(xiàn)配的FRAP工作液（0.1 mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液）3.9 mL加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的待測(cè)樣品，混勻反應(yīng)30 min，于593 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)10 min，讀取吸光度。以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品的抗氧化能力以FRAP值表示（1 FRAP單位=1 mmol/L FeSO4）。

1.3.6.2 ABTS＋?清除能力測(cè)定[15]

將7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液在暗處反應(yīng)16 h，得到ABTS+?離子液；使用前將離子液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度調(diào)整為0.700±0.02，30 ℃條件下平衡30 min；取2.0 mL ABTS+?，加入0.2 mL待測(cè)樣品，室溫混勻反應(yīng)20 min后，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。清除率計(jì)算見式（2）：

式中：A0為空白液吸光度；A1為樣品液吸光度。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定[16]

取3 mL DPPH（用95%的乙醇配成0.1 mmol/L濃度）溶液，加入2 mL待測(cè)樣品，室溫暗處反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。清除率計(jì)算見式（3）：

式中：A0為空白液吸光度；A1為樣品液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 提取溫度對(duì)駿棗多糖得率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on the yield of jujube polysaccharides

2.1.1 提取溫度對(duì)駿棗多糖得率的影響由圖1可知，隨著提取溫度的升高，多糖得率呈先升高再下降的趨勢(shì)。溫度從50 ℃升高到80 ℃過程中，多糖得率不斷升高，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高；繼續(xù)升溫，多糖得率略微下降，這可能和多糖遇高溫分解有關(guān)。因此，合理升溫有助于多糖的溶出，故選取70、80、90 ℃對(duì)駿棗多糖提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳提取溫度。

2.1.2 液固比對(duì)駿棗多糖得率的影響

圖2 液固比對(duì)駿棗多糖得率的影響Fig.2 Influence of liquid-to-solid ratio on the yield of jujube polysaccharides

由圖2可知，液固比（mL/g）從10∶1增加到15∶1時(shí)，多糖得率呈明顯上升趨勢(shì)，從15∶1增加到30∶1時(shí)，多糖得率雖略有下降，但變化趨勢(shì)平穩(wěn)。綜合考慮后續(xù)濃縮的需要，選取液固比為10∶1、15∶1、20∶1對(duì)駿棗多糖提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳提取液固比。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)駿棗多糖得率的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)駿棗多糖得率的影響Fig.3 Influence of extraction duration on the yield of jujube polysaccharides

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率不斷升高；但4 h后，延長(zhǎng)提取時(shí)間對(duì)多糖得率提升不明顯，綜合考慮能源和時(shí)間成本，選擇3、4、5 h對(duì)多糖提取作響應(yīng)面分析，以確定最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、液固比（B）和提取時(shí)間（C）為自變量，以駿棗多糖得率（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Box-Behnken design and results

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)表1中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到駿棗多糖得率的二次模型：

Y=—61.857 72+1.329 14A+1.238 55B+2.774 08C+ 5.300 8×10—4AB+6.552 37AC+0.017 817BC—8.230 96×10—3A2—0.040 227B2—0.418 91C2

用方差分析來評(píng)估模型的顯著性，如表2所示，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明模型對(duì)響應(yīng)值擬合良好。提取溫度（A）的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)及液固比（B）的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都達(dá)到極顯著水平，提取時(shí)間（C）的二次項(xiàng)達(dá)到顯著水平，表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。判定系數(shù)R2=95.09%，說明95.09%的響應(yīng)值變化可由方程中的3 個(gè)因素解釋[17]。該回歸方程可較好地描述各因素對(duì)駿棗多糖提取效果的影響，可預(yù)測(cè)在不同提取條件下阿克蘇駿棗多糖的得率。在各影響因素中，液固比對(duì)多糖得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間。

表2 回歸方程方差分析表Table2 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

圖4 提取溫度與液固比對(duì)駿棗多糖得率影響的響應(yīng)面Fig.4 Influence of extraction temperature and liquid-solid ratio on the yield of jujube polysaccharides

圖5 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)駿棗多糖得率影響的響應(yīng)面Fig.5 Influence of extraction time and temperature on the yield of jujube polysaccharides

由圖4可知，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨著液固比的增大，駿棗多糖得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，這可能是由于增加液固比降低了提取液的黏度，從而削弱了多糖擴(kuò)散阻力，利于多糖溶出，但過大的液固比會(huì)稀釋提取液，可能引起后續(xù)反應(yīng)中多糖的損失[18]；當(dāng)液固比一定時(shí)，隨提取溫度的升高，駿棗多糖得率也呈先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)樘岣邷囟扔欣跅椃鄢浞治苊?，多糖分子熱運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散溶出加劇，但溫度過高可能造成多糖降解[19-20]。由圖5、6可知，提取時(shí)間對(duì)多糖得率影響不大，這也與方差分析結(jié)果一致，綜合考慮能源和時(shí)間成本，可以在對(duì)優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整時(shí)，適當(dāng)減少浸提時(shí)間。

圖6 液固比與提取時(shí)間對(duì)駿棗多糖得率影響的響應(yīng)面Fig.6 Influence of liquid-to-solid ratio and extraction time on the yield of jujube polysaccharides

通過響應(yīng)面分析，得到駿棗多糖的最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度83℃、液固比17∶1（mL/g）、提取時(shí)間4.32 h，理論最佳得率為9.76%。為了檢驗(yàn)該參數(shù)的可行性，綜合考慮實(shí)際操作和生產(chǎn)成本后，以提取溫度83℃、液固比17∶1（mL/g）、提取時(shí)間4 h，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際平均得率為9.51%，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.081 1%，實(shí)際得率與理論值相差0.25%，說明該優(yōu)化工藝參數(shù)可用于指導(dǎo)阿克蘇駿棗多糖的提取。

2.3 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)，提取駿棗粗多糖，并按1.3.5節(jié)的方法對(duì)其進(jìn)行醇沉、脫色、脫蛋白，再對(duì)得到的純化多糖進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

2.3.1 鐵還原抗氧化能力

Fig.7 FRAP value of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C圖7 駿棗多糖和VC的FRAP值

鐵還原抗氧化能力（FRAP值）的測(cè)定結(jié)果見圖7。FRAP法是測(cè)定物質(zhì)總抗氧化能力的一種方法，其值越大，表明待測(cè)物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。由圖7可知，F(xiàn)RAP值與樣品的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度越高，F(xiàn)RAP值越大，樣品的抗氧化能力越強(qiáng)；與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比，駿棗多糖的總抗氧化能力明顯較弱，這可能是由于多糖在脫色和真空干燥時(shí)的操作溫度過高、時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。當(dāng)駿棗多糖的質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，其FRAP值為0.850；Li Jinwei等[21]的研究結(jié)果表明，超聲波提取的同等質(zhì)量濃度的駿棗多糖FRAP值接近0.7，而熱水提取的多糖FRAP值僅為0.5左右。說明超聲波預(yù)處理輔助熱水浸提法，比單純使用超聲波或熱水浸提得到的駿棗多糖的鐵還原抗氧化能力強(qiáng)。

2.3.2 ABTS＋?清除能力

BTS＋?的清除率Fig.8 ABTS＋? scavenging rate of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C圖8 駿棗多糖和VC對(duì)ABTS

由圖8可知，對(duì)ABTS+?的清除率隨樣品質(zhì)量濃度升高而增大，最高可達(dá)54.29%；與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比，駿棗多糖對(duì)ABTS+?的清除能力相對(duì)較弱。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，駿棗多糖對(duì)ABTS+?的清除率為40%左右，明顯高于渠琛玲等[22]關(guān)于新疆若羌紅棗多糖的研究結(jié)果，這可能與多糖提取工藝及紅棗品種有關(guān)。

圖9 駿棗多糖和VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.9 DPPH racial scavenging rate of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C

2.3.3 DPPH自由基清除能力由圖9可知，駿棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨樣品質(zhì)量濃度升高而增大；與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比，駿棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)較弱。當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，駿棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為51.43%，低于Li Jinwei等[21]的65%，更明顯低于渠琛玲等[22]熱水浸提法得到的3.0 mg/mL若羌紅棗多糖對(duì)

DPPH自由基的清除率。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于阿克蘇駿棗多糖提取研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取溫度、液固比和提取時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)駿棗多糖得率的影響均達(dá)到顯著水平，3 個(gè)因素對(duì)駿棗多糖得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。在各影響因素中，液固比對(duì)多糖得率的影響最大，其次是提取溫度和提取時(shí)間。

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化新疆阿克蘇駿棗多糖提取工藝條件，得到最佳提取工藝參數(shù)為：提取溫度83 ℃、液固比17∶1（mL/g）、提取時(shí)間4 h。駿棗粗多糖的實(shí)際平均得率為9.51%，經(jīng)回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此工藝參數(shù)合理可行。后續(xù)分離純化得到的駿棗多糖具有一定的清除ABTS+?和DPPH自由基能力，總抗氧化能力相對(duì)前人的研究結(jié)果較強(qiáng)，可能和純化工藝有關(guān)，還需探索和優(yōu)化。

與傳統(tǒng)熱水提取法相比，超聲波預(yù)處理結(jié)合熱水提取法提取紅棗多糖能顯著縮短提取時(shí)間，提高多糖提取得率，保持多糖的高抗氧化活性；但影響紅棗多糖提取得率的因素很多，有待深入研究。綜合考慮生產(chǎn)成本，可以嘗試?yán)贸暡A(yù)處理結(jié)合熱水提取法指導(dǎo)阿克蘇駿棗粗多糖的生產(chǎn)。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Capacity of Polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. Junzao

LI Yunlong1,2, YU Zhenyu3, GAO Haiyan1,2,*, YANG Hailong4, ZHENG Quan5, LI Xia5
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Fruits and Vegetables Postharvest and Processing Technology Research of Zh ejiang Province, Food Science Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 3. Aksu Vocational and Technical College, Aksu 843000, China; 4. College of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China; 5. Forestry Bureau of Zhuji City, Zhuji 311800, China; 6. Specialized Farmers Cooperatives of Aksu Maoyuan Fruit, Aksu 843000, China)

Polysaccharides with antioxidant activity were extracted from Zizyphus jujuba cv. Junzao fruits with hot water after ultrasonic pretreatment (120 W ultrasonic power, 60 ℃ for 30 min). Important extraction conditions were optimized by employing response surface methodology based on Box-Behnken design. An extraction temperature of 83 ℃ and 4 h extraction with a liquid-to-solid ratio of 17:1 (mL/g) were found to be optimal. The extraction yield of crude polysaccharides under the optimized conditions was 9.51%. The crude polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. Junzao had free radical scavenging capacity, and at a concentration of 5.0 mg/mL, the ABTS+? and DPPH racial scavenging rates were 54.29% and 51.43%, respectively.

response surface methodology; polysaccharides; ultrasonic; antioxidant capacities

TS255.36

A

1002-6630（2015）04-0045-05

10.7506/spkx1002-6630-201504009

2014-08-24

浙江省科技援疆項(xiàng)目（2011C16045）

黎云龍（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。E-mail：kaishi1206@163.com

*通信作者：郜海燕（1958—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺锪鞅ｕr與質(zhì)量控制。E-mail：spsghy@163.com