自由基清除劑預(yù)防創(chuàng)傷性異位骨化的實(shí)驗(yàn)研究①

閔紅巍，劉克敏，顧蕊，徐峰，韓新祚，亓攀

自由基清除劑預(yù)防創(chuàng)傷性異位骨化的實(shí)驗(yàn)研究①

閔紅巍，劉克敏，顧蕊，徐峰，韓新祚，亓攀

目的比較口服非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)和靜脈應(yīng)用自由基清除劑對(duì)創(chuàng)傷性異位骨化動(dòng)物模型的療效。方法48只新西蘭白兔隨機(jī)分成對(duì)照組、NSAIDs組、自由基清除劑組和聯(lián)合治療組，每組各12只。建立創(chuàng)傷性異位骨化模型，NSAIDs組、自由基清除劑組和聯(lián)合治療組分別予口服吲哚美辛、靜脈注射依達(dá)拉奉以及聯(lián)合應(yīng)用兩藥，對(duì)照組予生理鹽水，共用藥4周。分別于術(shù)后8周、12周行X線檢查，觀察各組異位骨化的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。結(jié)果術(shù)后8周、12周，NSAIDs組異位骨化發(fā)生率為33.3%和41.7%，自由基清除劑組異位骨化發(fā)生率為43%和45.8%，聯(lián)合治療組異位骨化的發(fā)生率為29.2%和37.5%，對(duì)照組異位骨化的發(fā)生率為70.8%和75%。各治療組異位骨化的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均低于對(duì)照組(P＜0.05)，而各治療組之間異位骨化的發(fā)生率和嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論全身應(yīng)用自由基清除劑可有效地預(yù)防異位骨化形成，其效果與NSAIDs相當(dāng)。兩者不存在協(xié)同作用。

創(chuàng)傷性異位骨化；自由基清除劑；預(yù)防；兔

[本文著錄格式]閔紅巍，劉克敏，顧蕊，等.自由基清除劑預(yù)防創(chuàng)傷性異位骨化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015, 21(4):422-425.

CITED AS:Min HW,Liu KM,Gu R,et al.Effect of free radical scavenger on prevention of traumatic heterotopic ossification in rabbits[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4):422-425.

異位骨化是指在沒(méi)有骨組織的部位出現(xiàn)板層骨結(jié)構(gòu)，是骨科常見的并發(fā)癥。它不僅能使受累的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，增加并發(fā)癥(壓瘡、泌尿系感染、血管神經(jīng)卡壓等)出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)，還能使原有疾病的癥狀加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，創(chuàng)傷性異位骨化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此找到有效的防治方法非常困難。傳統(tǒng)的防治方法，如非甾體類抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、放射治療等，都有其局限性[1]。本研究探討全身應(yīng)用自由基清除劑的療效，并與傳統(tǒng)的NSAIDs進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

雄性新西蘭白兔48只，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，體重(2.5±0.5)kg，年齡4～5個(gè)月。采用隨機(jī)數(shù)字表將動(dòng)物分為NSAIDs組、自由基清除劑組、聯(lián)合治療組和對(duì)照組，每組12只。普通環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 造模方法

家兔俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，雙側(cè)髖關(guān)節(jié)備皮。5%戊巴比妥鈉0.5 ml/kg靜脈注射麻醉。以大轉(zhuǎn)子為中心，做長(zhǎng)約4 cm直切口，切開皮膚、皮下和深筋膜，分離臀大肌，部分剝離大轉(zhuǎn)子部肌肉止點(diǎn)；在大轉(zhuǎn)子尖骨面用直徑2.5 mm鉆頭鉆通髓腔，至髓腔內(nèi)容物流出。止血鉗鉗夾臀中肌3 min，造成局部組織缺氧。逐層縫合深筋膜、皮下和皮膚。

1.3 干預(yù)方法

NSAIDs組于造模后第1天予吲哚美辛口服，起始劑量10 mg/kg，每天1次；2周后減至5 mg/kg。吲哚美辛膠囊(張家口市東風(fēng)制藥廠，批號(hào)200301001)內(nèi)粉末混于生理鹽水，搖勻后制成合適濃度懸浮液。注射器抽取合適劑量后，通過(guò)硬飼喂管注入家兔食道。

自由基清除劑組于造模后第1天予依達(dá)拉奉(吉林輝南長(zhǎng)龍生化藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20120407)20 mg加入適量生理鹽靜脈滴注，每天1次。

聯(lián)合治療組同時(shí)給予吲哚美辛和依達(dá)拉奉，方法同前。對(duì)照組予口服生理鹽水。4組動(dòng)物均用藥4周。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 一般情況

術(shù)后未應(yīng)用抗生素和鎮(zhèn)痛藥物，籠內(nèi)自由放養(yǎng)，密切觀察動(dòng)物一般情況、傷口愈合和雙后肢活動(dòng)。

1.4.2 影像學(xué)觀察

各組動(dòng)物分別于術(shù)后8周、12周行雙側(cè)髖關(guān)節(jié)正位X線攝片，觀察是否有異位骨化發(fā)生、異位骨化的部位和范圍。

異位骨化評(píng)價(jià)按Delee分型[2]。0級(jí)：無(wú)異位骨化形成；Ⅰ級(jí)：異位骨化范圍未超過(guò)股骨與骨盆距離的50%；Ⅱ級(jí)：異位骨化范圍超過(guò)股骨與骨盆距離的50%，但未形成橋接；Ⅲ級(jí)：股骨與骨盆間形成骨橋，骨性強(qiáng)直。評(píng)級(jí)由兩名醫(yī)生共同完成。計(jì)算各組的平均分級(jí)。

平均分級(jí)=(0級(jí)例數(shù)×0+Ⅰ級(jí)例數(shù)×1+Ⅱ級(jí)例數(shù)× 2+Ⅲ級(jí)例數(shù)×3)/總例數(shù)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各組異位骨化發(fā)生率比較采用χ2檢驗(yàn)；各組異位骨化的嚴(yán)重程度(各分級(jí)例數(shù)和平均分級(jí))比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H法，兩兩比較采用Mann-Whitney U法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

48只家兔術(shù)后死亡3只，死亡時(shí)間為術(shù)后13～21 d。兔尸檢見胃穿孔和胃黏膜糜爛潰瘍。由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的冗余備份補(bǔ)充。

各組平均分級(jí)見圖1。術(shù)后8周、12周，各治療組異位骨化發(fā)生率和嚴(yán)重程度均低于對(duì)照組(P＜0.05)，各治療組間異位骨化發(fā)生率和嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2、圖2。

圖1 術(shù)后8周和12周各組異位骨化的平均分級(jí)

表1 術(shù)后8周各組髖關(guān)節(jié)異位骨化發(fā)生情況比較(n)

表2 術(shù)后12周各組髖關(guān)節(jié)異位骨化發(fā)生情況比較(n)

圖2 各組X線片示例

3 討論

1883年，Riedel首次系統(tǒng)描述異位骨化這一現(xiàn)象。到目前為止，其發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。異位骨化可分為遺傳性和繼發(fā)性兩大類。繼發(fā)性異位骨化最常見于人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后和骨盆骨折；遺傳性異位骨化則常見于中軸骨，但也可以影響其他關(guān)節(jié)。異位骨化一旦形成，無(wú)法改變其自然病程[3]，只有手術(shù)切除才能根治，而術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高。因此早期預(yù)防尤為重要。

目前，異位骨化防治的方法包括藥物(雙磷酸鹽類、NSAIDs、秋水仙堿、維生素K抑制劑、脂多糖[4]、選擇性視黃酸受體激動(dòng)劑[5])、放射治療[6]、物理治療、脈沖電磁場(chǎng)、手術(shù)治療、金屬微粒[7]、基因治療等。傳統(tǒng)方法如NSAIDs和放射治療副作用較大，而其他治療方法，如金屬微粒和基因治療等還處于實(shí)驗(yàn)階段，是否能應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步探索。

目前，繼發(fā)性異位骨化的動(dòng)物模型主要有6種。①植入物模型：植入誘導(dǎo)刺激物，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓干細(xì)胞、磷酸鈣等。②髖部手術(shù)模型：1984年，Schneider介紹一個(gè)模仿人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的動(dòng)物模型[8]；2005年，Rumi成功地利用此模型進(jìn)行放射治療預(yù)防異位骨化最佳時(shí)間的研究，并且確認(rèn)引起異位骨化的骨前體細(xì)胞的起源[9]。③制動(dòng)-按摩模型：膝關(guān)節(jié)制動(dòng)后強(qiáng)力被動(dòng)活動(dòng)。④直接創(chuàng)傷模型：如股四頭肌鈍性打擊、爆炸性截肢模型[10]。⑤跟腱切斷模型。⑥肌肉內(nèi)注射刺激物，如乙醇。這些模型的可重復(fù)性和臨床相關(guān)性不盡相同。髖部手術(shù)模型和爆炸性截肢模型是以發(fā)病機(jī)制為基礎(chǔ)的動(dòng)物模型，臨床相關(guān)性較好。

本研究所采用的動(dòng)物模型[11]是對(duì)髖部手術(shù)模型的改良。術(shù)中鉆通髓腔，把髓腔內(nèi)容物引入肌肉中；同時(shí)鉗夾臀中肌，造成局部組織缺氧。同時(shí)獲得成骨誘導(dǎo)物、具有成骨潛能的干細(xì)胞以及良好的組織環(huán)境3個(gè)要素，理論上認(rèn)為此模型將獲得較高的異位骨化發(fā)生率。此模型的優(yōu)點(diǎn)是形成異位骨化的創(chuàng)傷機(jī)制與臨床接近，因此有良好的臨床指導(dǎo)意義。本組對(duì)照組術(shù)后12周時(shí)異位骨化發(fā)生率達(dá)75%，可以認(rèn)為造模成功，適于異位骨化防治的研究。

NSAIDs是目前公認(rèn)最有效的預(yù)防異位骨化形成的藥物。臨床常用的有吲哚美辛[12]、塞來(lái)西布[13]、萘普生等。其作用機(jī)制為抑制環(huán)氧化酶，阻止前列腺素E介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并抑制間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[14-15]。NSAIDs藥物的副作用較大，包括胃腸道反應(yīng)、出血、影響骨折愈合等。

異位骨化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為可能與體液因素、神經(jīng)免疫因素和局部因素有關(guān)。Gear等提出異位骨化形成必須具備3個(gè)條件：成骨前體細(xì)胞、成骨誘導(dǎo)因子、合適的組織環(huán)境[16]。Kaplan等提出影響異位骨化形成的一些因素：初始的刺激因素、損傷部分信號(hào)的傳出、未定向分化的間充質(zhì)干細(xì)胞和合適的局部組織壞境[17]。

創(chuàng)傷后異位骨化常發(fā)生于傷后2～4個(gè)月。本研究顯示，對(duì)照組術(shù)后12周異位骨化的發(fā)生率高達(dá)75%，與文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)病時(shí)間相符。NSAIDs組異位骨化的發(fā)生率和嚴(yán)重程度明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明NSAIDs能預(yù)防異位骨化形成，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[18]。術(shù)后8周和12周，自由基清除劑組異位骨化的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均低于對(duì)照組，表明自由基清除劑也能預(yù)防異位骨化的發(fā)生。

自由基可改變細(xì)胞膜的通透性，促使興奮性神經(jīng)

遞質(zhì)釋放，激活細(xì)胞膜蛋白酶和磷脂酶，導(dǎo)致局部組織壞死。局部壞死組織和低氧環(huán)境導(dǎo)致巨噬細(xì)胞聚集、釋放腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1等炎癥介質(zhì)。這些炎癥介質(zhì)可刺激單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞內(nèi)環(huán)氧化酶-2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致前列腺素釋放；炎癥介質(zhì)還可導(dǎo)致體內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生蛋白、催乳素、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等的釋放增加，這些因子參與骨重建過(guò)程，在異位骨化的發(fā)生中起重要作用[19]。自由基清除劑依達(dá)拉奉能降低羥自由基濃度，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和花生四烯酸釋放，從而降低前列腺素E、環(huán)氧化酶-2表達(dá)，改變異位骨化形成的局部環(huán)境因素和誘導(dǎo)因子濃度，從而預(yù)防異位骨化的形成。有文獻(xiàn)報(bào)道，依達(dá)拉奉可下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和環(huán)氧化酶-2表達(dá)[20]，對(duì)預(yù)防異位骨化具有積極重要的意義。

異位骨化發(fā)生的病理生理過(guò)程可能存在缺氧狀態(tài)，局部組織缺氧產(chǎn)生大量自由基。因此有學(xué)者將自由基的產(chǎn)生和異位骨化的發(fā)生過(guò)程聯(lián)系在一起。Vanden等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，自由基清除劑別嘌呤醇和乙酰半胱氨酸具有預(yù)防異位骨化的作用[21-22]，與本研究的結(jié)果一致。

本研究顯示，3個(gè)治療組之間，異位骨化的發(fā)病率和嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異，說(shuō)明NSAIDs和自由基清除劑之間無(wú)協(xié)同作用。

本研究的局限性：一方面樣本量較少；另一方面觀察的時(shí)間點(diǎn)比較少。要將自由基清除劑預(yù)防異位骨化應(yīng)用于臨床，尚需進(jìn)一步明確自由基清除劑的最佳劑量，自由基清除劑的生物活性、在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間及其最佳應(yīng)用時(shí)間。尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Free Radical Scavenger on Prevention of Traumatic Heterotopic Ossification in Rabbits

MIN Hong-wei,LIU Ke-min,GU Rui,XU Feng,HAN Xin-zuo,QI Pan
1.School of Rehabilitation Medicine,Capital Medical University,Beijing 100068,China;2.Department of Orthopedics and Rehabilitation,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

Objective To compare the effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDs)and free radical scavengers(FRS)on formation of traumatic heterotopic ossification(HO)in rabbits.Methods 48 New Zealand rabbits were randomly divided into control group (n=12),NSAIDs group(n=12),FRS group(n=12)and combination group(n=12).The model of traumatic HO was established,and the NSAIDs group,FRS group and combination group were administered indometacin intragastrically,edaravone intravenously and both,respectively,while the control group was administered normal saline for 4 weeks.The incidence and severity of HO were observed with X-ray 8 and 12 weeks after modeling.Results 8 and 12 weeks after operation,the incidence of HO was 33.3%and 41.7%in the NSAIDs group, 43.0%and 45.8%in the FRS group,29.2%and 37.5%in the combination group,and 70.8%and 75.0%in the control group,respectively. The incidence and severity of HO in all the treatment groups were significantly less than those in the control group(P＜0.05),and there was no significant difference among the treatment groups(P＞0.05).Conclusion The systemic application of FRS may prevent the formation of HO effectively,similar with the NSAIDs.There is no synergistic effect between them.

traumatic heterotopic ossification;free radical scavenger;prevention;rabbits

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.012

R68

A

1006-9771(2015)04-0422-04

2014-12-19

2015-01-12)

1.中國(guó)康復(fù)研究中心科研基金項(xiàng)目(No.2010-Q2)；2.北京豐臺(tái)區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)科學(xué)研究項(xiàng)目(No.2014-豐臺(tái))。

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院骨科，北京市100068。作者簡(jiǎn)介：閔紅巍(1971-)，男，漢族，黑龍江哈爾濱市人，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：骨關(guān)節(jié)康復(fù)。通訊作者：劉克敏。E-mail:keminlqliu@sina.com。