一年二十四節(jié)氣中新鮮與陰干黃芩根黃酮類成分含量對比及其相關(guān)性

周安莉，馮小艷，周國軍，李 焱，周銅水

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院及天然藥物研究中心，上海 200438)

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是唇形科黃芩屬多年生草本植物，傳統(tǒng)以干燥根入藥，為我國歷史悠久的大宗藥材。黃芩性寒味苦，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血安胎等功效，常用于濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，肺熱咳嗽，高熱煩渴，胎動不安等癥［1］。黃芩的主要活性成分是黃酮類化合物，以黃芩苷(baicalin)、漢黃芩苷(wogonoside)、黃芩素(baicalein)和漢黃芩素(wogonin)為主［2］。這些成分具有抗癌、抗菌抗病毒、抗氧化、抗炎、降糖降脂、保護心腦血管及神經(jīng)元等作用［3－5］?！吨袊幍洹芬渣S芩苷作為評價黃芩藥材質(zhì)量的指標(biāo)，規(guī)定其干燥品含量不得低于 9%［1］。

目前，針對各產(chǎn)地種植黃芩的最佳采收年限、最佳采收季節(jié)，以及黃芩中各種黃酮類成分的動態(tài)變化規(guī)律已有諸多報道［6－8］。但多數(shù)實驗只針對傳統(tǒng)采收期即春、秋兩季，進行數(shù)月、最長不超過半年的連續(xù)研究，且基本上僅關(guān)注干燥的黃芩藥材。對于連續(xù)一年二十四節(jié)氣生長過程中黃酮類成分的動態(tài)變化，尚無研究報道。此外，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩根的黃酮類成分與丹參的化學(xué)成分一樣，主要也是在采后干燥過程中產(chǎn)生的［9－12］，對于不同產(chǎn)地丹參藥材的分析結(jié)果都得出同樣結(jié)論［13］。本文旨在進一步探討:(1)一年二十四節(jié)氣黃芩根中黃酮類成分是否都是在陰干過程中產(chǎn)生的;(2)干燥根中黃酮類成分含量與新鮮根中原有成分含量的相關(guān)性;(3)一年二十四節(jié)氣中苷、苷元的消長變化規(guī)律。研究結(jié)果為進一步證實采后干燥誘導(dǎo)丹參、黃芩等根類藥材活性成分的產(chǎn)生，以及闡述黃芩中黃酮類成分的形成與轉(zhuǎn)化機制提供更充分依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司，配置有G1361A二元高壓梯度泵，G1322A在線脫氣機，G1315B二極管陣列檢測器，ChemStation化學(xué)工作站);Agilent Zorbax SB－C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);DL－180A型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);BP110S型電子天平(Sartorius);紅外線快速水分測定儀(深圳市冠亞電子科技有限公司)。

色譜純?nèi)宜豳徸試幖瘓F化學(xué)試劑有限公司;色譜純乙腈購自百靈威科技有限公司;水為雙蒸水;其余均為國產(chǎn)分析純試劑。對照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素購自上海友思生物科技有限公司，純度均大于98%。

1.2 實驗材料 新鮮黃芩根自2013年5月(移栽苗)至2014年5月連續(xù)一年按照節(jié)氣采收(表1)。所有新鮮樣品在采收地立即進行如下處理:洗盡泥沙，一部分立即冷藏于－20℃冰箱中，另一部分以整株狀態(tài)懸掛于陰涼處陰干1個月(室內(nèi)自然溫度5～30℃，濕度25% ～70%)。各季度樣品帶回實驗室后保持原有狀態(tài)，直至測試。所有樣品于測定前經(jīng)液氮冷凍后粉碎。取樣品粉末，一部分用于水分測定，并根據(jù)水分含量折算粉末干重;另一部分用于測定黃酮類成分含量，各樣品重復(fù)分析3次。

表1 2013—2014年二十四節(jié)氣及樣品采收時間

2 實驗方法

2.1 樣品水分含量測定 黃芩根樣品含水量測定利用紅外線快速水分測定儀完成。每份樣品重復(fù)3次。

2.2 黃酮類成分含量測定 采用本實驗室已報道的方法［12］。各成分的線性回歸方程分別為黃芩苷:Y=38.30X－14.09;漢黃芩苷:Y=52.98X+13.95;黃芩素:Y=55.79X－39.15;漢黃芩素:Y=74.22X+7.763。相關(guān)系數(shù) r均大于0.999，線性范圍依次為:0.51 ～164、0.33 ～104、0.24 ～76、0.31 ～100 mg·L－1。對該含量測定方法的日間精密度、日內(nèi)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率等進行了系統(tǒng)方法學(xué)考察，結(jié)果RSD值均小于5%，表明該方法穩(wěn)定、可靠，可用于黃芩藥材的質(zhì)量分析研究［12］。樣品含量測定:精密稱取干重0.2 g的黃芩根樣品粉末，加入15 mL 70%乙醇，超聲處理30 min，5 000 r·min－1離心 10 min，上清倒入 50 mL 容量瓶;重復(fù)用70%乙醇提取一次，合并上清到50 mL容量瓶，70%乙醇定容至50 mL，用0.22μm微孔濾膜過濾即得供試品溶液。按上述HPLC方法測定4種黃酮類成分的含量，每份樣品重復(fù)實驗3次［12］。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)處理用Microsoft Excel軟件完成;圖表制作利用 SigmaPlot 11.0完成。數(shù)據(jù)間顯著性、相關(guān)性與回歸分析利用SPSS 19.0軟件完成。

3 結(jié)果

3.1 新鮮與陰干黃芩根中水分含量變化 新鮮及陰干根樣品的含水量如圖1A所示，由于種植地天氣變化、黃芩生長狀態(tài)變化等導(dǎo)致新鮮根中的含水量有一定波動。整體來看，夏、春兩季的新鮮根含水量較高，平均分別為65.13%和61.39%;秋、冬兩季較低，平均分別為51.17%和54.00%。在大暑(2013年7月22日)當(dāng)日新鮮根含水量達全年峰值，為(68.28±1.67)%。而在立秋(2013年8月7日)過后含水量迅速下降，至白露(2013年9月7日)時含水量僅為(47.98±1.85)%，之后新鮮根中含水量波動較為平緩，全年最低值出現(xiàn)在立冬(2013年11月7日)，為(47.12±0.55)%。而陰干后黃芩根中含水量較新鮮均大大降低，范圍為(9.00±0.32)% ～ (15.53 ±0.64)%，平均值為12.60%。

3.2 新鮮及陰干黃芩根中苷類成分和總黃酮的變化 二十四節(jié)氣新鮮和陰干黃芩根中的苷類成分及四種黃酮總量(簡稱總黃酮)的變化如圖1B～E所示。對比新鮮與陰干根中的總苷類成分(圖1B)可發(fā)現(xiàn)，除22(清明)和23號(谷雨)兩樣品外，陰干后根中的總苷含量均有極顯著增加(P＜0.01)。一年二十四節(jié)氣新鮮根總苷含量變化范圍為(37.68 ±2.18)～(169.59 ±6.52)mg·g－1，平均值為99.56 mg·g－1;陰干根變化范圍為(108.95 ±6.44)～ (260.68 ± 13.19)mg·g－1，平均值為181.19 mg·g－1，增加了近 1 倍。尤其是 1 號樣品(小滿)新鮮根的總苷含量僅為(39.78±4.66)mg·g－1，陰干后增加近 4 倍，達(190.47 ±12.57)mg·g－1。而新鮮與陰干根中的黃芩苷含量變化與總苷基本一致(圖1C)，即陰干根中的黃芩苷含量較新鮮根有極顯著增加(P＜0.01)。這是因為黃芩苷是主要的苷類成分，一般占總苷七成以上。新鮮根黃芩苷含量為(22.35 ±1.01)～(137.85 ±7.78)mg·g－1，平均值 75.46 mg·g－1;陰干根黃芩苷含量為(87.92 ±5.15)～ (216.87 ±10.18)mg·g－1，平均值151.48 mg·g－1。漢黃芩苷在新鮮根與陰干根中的含量差異并不明顯(圖1D)，陰干處理未使其呈現(xiàn)有規(guī)律的增高或降低。

陰干處理后大部分節(jié)氣中總黃酮含量亦明顯上升(圖1E)，但增幅沒有總苷含量顯著。新鮮根總黃酮含量為(118.02±11.22)～(224.52 ±4.40)mg·g－1，平均值 165.74 mg·g－1;陰干根總黃酮含量為(159.38 ±8.57)～ (283.95 ±14.70)mg·g－1，平均值 210.89 mg·g－1，較新鮮根中增加 27.24%。

3.3 新鮮及陰干黃芩根中苷元類成分變化 與總苷相反，陰干處理后根中總苷元含量基本上均有極顯著降低(圖2A)。一年二十四節(jié)氣的新鮮根總苷元含量變化范圍為(34.47±2.96)～(89.53±13.46)mg·g－1，平均值為 66.19 mg·g－1;而陰干根中為(11.6 ±0.62)～(71.19 ±6.77)mg·g－1，平均值為29.70 mg·g－1，減少超一半。黃芩素含量在新鮮與陰干根中的變化與總苷元類似(圖2B)，且減少得更加明顯。一年二十四節(jié)氣中，新鮮根黃芩素含量為(31.69 ±2.64)～ (74.45 ±1.48)mg·g－1，平均值 57.91 mg·g－1;陰干根黃芩素含量為(10.25 ±0.76)～ (54.93 ±5.45)mg·g－1，平均值24.10 mg·g－1。而漢黃芩素含量在新鮮與陰干根中變化無明顯規(guī)律(圖2C)。

3.4 新鮮與陰干黃芩根中苷元與苷類成分的比值變化 新鮮根的總苷元/總苷及黃芩素/黃芩苷數(shù)值變化范圍分別為 0.27 ～2.36 及 0.30 ～3.12，說明在新鮮根中黃芩苷與黃芩素含量并沒有太明顯的差距。而經(jīng)過陰干處理后，總苷元/總苷及黃芩素/黃芩苷的數(shù)值都明顯降低，且明顯小于1，變化范圍分別為 0.06 ～0.57 及 0.06 ～0.53，即陰干根中黃芩素含量基本不足黃芩苷的一半。漢黃芩素與漢黃芩苷的比值則波動更大，新鮮根與陰干根中也沒有明顯的區(qū)別，基本上均＜1。說明無論在新鮮還是陰干樣品中，漢黃芩素含量均少于漢黃芩苷含量。

3.5 陰干與新鮮黃芩根中黃酮類成分含量變化相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果表明，無論是在新鮮根還是陰干根中，黃芩苷與漢黃芩苷均呈極顯著的正相關(guān)(P＜0.01)，而與黃芩素，漢黃芩素均呈極顯著的負(fù)相關(guān)性。值得注意的是，陰干根中四種黃酮類成分含量變化與新鮮根中相關(guān)成分的原有含量沒有相關(guān)性，說明陰干樣品中黃芩苷(總苷)成分的增加不是由新鮮樣品中的相關(guān)成分直接轉(zhuǎn)化而來。

4 討論

本實驗自2013年5月開始，連續(xù)一年對山東栽培黃芩的新鮮及陰干根中四種黃酮類成分變化進行了追蹤、分析和比較。其中，黃芩苷是中藥黃芩中含量最多、最主要的活性成分，也是我們關(guān)注的重點。一年二十四節(jié)氣中，新鮮黃芩根中的黃芩苷含量多數(shù)時候難以達到藥典的要求，而陰干處理后黃芩苷含量顯著增加，基本上均能大大超過藥典的要求，有些甚至能超過藥典規(guī)定的兩倍，與本實驗室前期結(jié)果有一致性［12］?？傑占翱傸S酮含量亦增加明顯，黃芩素和總苷元含量則顯著降低，陰干處理后黃芩素含量基本不足黃芩苷的一半。實驗證實了黃芩根的黃酮苷類成分與丹參的活性成分丹酚酸B類似［9］，主要也是在采后干燥脅迫過程中產(chǎn)生。這是因為植物的次生代謝產(chǎn)物通常是水份、溫度、蟲害等環(huán)境脅迫的產(chǎn)物，干燥過程對于新鮮采收的植物體尤其根來說，事實上就是一個干旱脅迫的過程，可能誘導(dǎo)活性成分的大量形成和升高［14］。這些研究結(jié)果和發(fā)現(xiàn)對于中藥材GAP生產(chǎn)具有重要的理論和應(yīng)用價值［9］。

對于四種黃酮類成分含量進行相關(guān)性分析可發(fā)現(xiàn)，新鮮和陰干根中黃芩苷均與漢黃芩苷呈極顯著正相關(guān)，而與黃芩素及漢黃芩素呈極顯著負(fù)相關(guān)。但是陰干根中四種黃酮類成分的含量變化與新鮮根中原有黃酮類成分含量沒有相關(guān)性，亦即干燥過程中黃芩苷類成分的增加不是由新鮮植物體中黃芩素等苷元成分直接轉(zhuǎn)化而來。這一結(jié)果與我們先前報道的“在黃芩新鮮樣品、黃芩苷持續(xù)上升的早期干燥階段、以及黃芩苷下降的后期干燥階段，都沒有檢測到高含量的黃芩苷合成必要的前體和降解產(chǎn)物黃芩素的存在”的結(jié)果完全一致［9］。推測干燥早期階段黃芩苷的形成可能是由黃芩根中淀粉、糖等儲備營養(yǎng)成分為抵御干燥脅迫而重新啟動和轉(zhuǎn)化而來，而在干燥后期黃芩苷降解形成的黃芩素即刻被用于抗氧化而快速消耗［9］。這方面的研究工作正在研究過程中。

本實驗證實在一年二十四節(jié)氣中，陰干處理都導(dǎo)致有效成分黃芩苷含量的顯著上升以及黃芩素含量的顯著下降，且陰干根中黃酮苷類成分的含量增加與新鮮根中原有成分的含量無相關(guān)性。該研究結(jié)果為我們發(fā)現(xiàn)的采后干燥是根類藥材活性成分形成和積累的關(guān)鍵時期這一結(jié)論提供了新的證據(jù)，也為優(yōu)質(zhì)黃芩藥材的GAP生產(chǎn)提供重要參考。有關(guān)新鮮及陰干黃芩中黃酮類成分的動態(tài)變化與氣候因子的相關(guān)性分析，將另文討論。

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