莫諾苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響①

侯虹麗，孫芳玲，艾厚喜，張麗，王文

莫諾苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響①

侯虹麗1，孫芳玲2，艾厚喜2，張麗2，王文2

目的研究莫諾苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注3 d皮層梗死周邊區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達(dá)的影響。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=3)，模型組(n=3)，莫諾苷小劑量組(n=3)、中劑量組(n=3)及大劑量組(n= 3)。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)30 min再灌注模型。術(shù)后3 h，莫諾苷各組予莫諾苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。術(shù)后3 d，免疫組化染色觀察腦缺血皮層梗死周邊區(qū)MMP-2、MMP-9表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組皮層梗死周邊區(qū)MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，莫諾苷各組MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論莫諾苷能降低大鼠腦缺血再灌注3 d皮層梗死周邊區(qū)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而保護(hù)血腦屏障功能。

腦缺血再灌注；莫諾苷；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；大鼠

[本文著錄格式]侯虹麗，孫芳玲，艾厚喜，等.莫諾苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮層梗死周邊區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(1):5-8.

CITED AS:Hou HL,Sun FL,Ai HX,et al.Effects of morroniside on expression of matrix metalloproteinases in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):5-8.

缺血性腦卒中是由于腦血管內(nèi)發(fā)生血栓、栓塞或其他原因?qū)е履X供血不足而引起的腦血管疾病[1-2]。腦卒中后急性期，除了細(xì)胞死亡外，另一個(gè)非常重要的損傷機(jī)制是神經(jīng)血管單元損傷，這種損傷已被證明可破壞血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的功能[3-4]。血腦屏障是由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形細(xì)胞等組成的復(fù)雜系統(tǒng)，是維持腦內(nèi)微環(huán)境的重要結(jié)構(gòu)，其通透性與中樞神經(jīng)的損傷、炎癥等有密切關(guān)系[5]。腦缺血再灌注后血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞[6]：結(jié)構(gòu)破壞主要表現(xiàn)為包繞微血管的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生腫脹和退行性改變、毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞特性改變等；功能改變主要表現(xiàn)為通透性改變。血腦屏障的通透性改變與缺血后再灌注的時(shí)間密切相關(guān)。缺血再灌注3 h，血腦屏障的通透性開(kāi)始增加；再灌注24 h，血腦屏障通透性升至高峰，維持至48 h；再灌注72 h以后血腦屏障的通透性逐漸減小[7]。因此，在腦缺血再灌注損傷中，抓住血腦屏障的3 h治療窗，對(duì)腦卒中的治療意義深遠(yuǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶類中最重要的一類，在生

理和病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它們作為最重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，與血腦屏障損傷關(guān)系最為密切[8]。目前研究認(rèn)為，MMP-2的表達(dá)與腦缺血再灌注后早期血腦屏障的開(kāi)放有關(guān)，而MMP-9與缺血再灌注后血腦屏障的第2次開(kāi)放有關(guān)[9]。MMP-2、MMP-9激活后，參與降解血腦屏障基膜的主要成分，促使血腦屏障開(kāi)放，破壞腦保護(hù)屏障，引起血腦屏障的通透性增加，造成進(jìn)一步損傷[10]。

莫諾苷是我們從山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷類重要單體成分。我們的前期研究除了驗(yàn)證莫諾苷體外抗氧化和抗凋亡的功能外[11-12]，體內(nèi)試驗(yàn)表明，莫諾苷能減小局灶性腦缺血損傷模型大鼠的大腦梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]。本研究中我們對(duì)莫諾苷調(diào)節(jié)MMPs的活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行研究，為腦卒中治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只，體重260～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0009。12 h晝夜循環(huán)清潔級(jí)飼養(yǎng)，預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠編號(hào)1～15，用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小、中、大劑量組，共5組，每組3只。

莫諾苷由本實(shí)驗(yàn)室從中藥山茱萸的干燥成熟果肉中提取。高效液相色譜儀對(duì)組分進(jìn)行分析，純度98.5%。使用時(shí)將其溶于蒸餾水。術(shù)后3 h開(kāi)始，莫諾苷小、中、大劑量組按30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃給藥。假手術(shù)組和模型組予等體積蒸餾水。

1.2 主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0.26 mm(2634-100)：北京沙東生物技術(shù)有限公司。Thermo Scientific輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：上海萊卡儀器有限公司。Olympus BX51顯微鏡：日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。MMP-2抗體：武漢博士德生物工程有限公司。MMP-9抗體：美國(guó)SANTA CRUZ公司。DAB顯色試劑盒：上?；蚩萍加邢薰?。

1.3 模型制備

參考Longa線栓法[14]制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大鼠造模前一晚禁食，自由飲水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸部消毒，切開(kāi)右側(cè)頸部，逐層分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈，分別結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈及右側(cè)頸外動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈近動(dòng)脈分叉處剪一小口，將線栓插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈約18～20 mm，感到輕微阻力時(shí)立即停止插線?？p合傷口，抗生素預(yù)防感染，留置線頭于體外。30 min后拔出尼龍線。

假手術(shù)組麻醉后進(jìn)行相同手術(shù)操作，但不插線。

術(shù)后控制室溫25～30℃，3 h后動(dòng)物清醒，觀察其行為。依據(jù)Longa 5分法進(jìn)行術(shù)后行為學(xué)評(píng)分：0分，正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)，向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時(shí)，向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。評(píng)分1～3分為造模成功，0和4分淘汰。采用差額補(bǔ)充方法補(bǔ)足各組設(shè)計(jì)所需大鼠數(shù)量。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 腦組織切片

術(shù)后3 d，所有大鼠10%水合氯醛20 ml/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，快速剪開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包膜，暴露心臟和主動(dòng)脈弓。用9號(hào)針頭插入左心室至主動(dòng)脈，灌注生理鹽水；待右心耳流出液無(wú)色透明時(shí)，用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，直至動(dòng)物呈僵硬狀態(tài)。灌注0.5 h后開(kāi)顱取腦，將腦組織浸于后固定液中過(guò)夜。腦組織冰凍切片，厚40 μm，取前囪前1.60 mm到后0.2 mm，10個(gè)切片，每個(gè)腦組織選3個(gè)切片。

1.4.2 染色

所選切片于新鮮配制的3%H2O2室溫孵育10 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加5%～10%正常山羊或兔血清，室溫孵育30 min，傾去；滴加MMP-2、MMP-9一抗工作液(1∶200)，4℃過(guò)夜；PBST洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記抗兔或鼠二抗工作液，37℃搖床孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加適量的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；新鮮配制的DAB室溫顯色5～10 min；水洗，梯度乙醇脫水，卵白素-生物素過(guò)氧化物酶聯(lián)合3,3'-二氨基聯(lián)苯胺復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.4.3 圖像分析

光學(xué)顯微鏡觀察皮層梗死周邊區(qū)MMP-2、MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞。選擇梗死區(qū)邊緣皮層區(qū)域3個(gè)感興趣區(qū)域(400×300 μm)，用Image-pro Plus圖像分析系

統(tǒng)計(jì)數(shù)MMP-2、MMP-9免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(IOD)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MMP-2

MMP-2免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞呈星形膠質(zhì)細(xì)胞狀表達(dá)(圖1)。模型組MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比假手術(shù)組顯著升高(P＜0.001)；莫諾苷各組MMP-2表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

2.2 MMP-9

MMP-9免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞呈神經(jīng)元細(xì)胞狀表達(dá)(圖2)。模型組MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)；莫諾苷各組MMP-9表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后3 d皮層梗死周邊區(qū)MMPs表達(dá)(IOD)

圖1 各組術(shù)后3 d皮層梗死周邊區(qū)MMP-2表達(dá)(免疫組化染色，40×)

圖2 各組術(shù)后3 d皮層梗死周邊區(qū)MMP-9表達(dá)(免疫組化染色，40×)

3 討論

腦卒中后MMPs對(duì)血腦屏障的損傷起著決定性作用[15]，MMPs與缺血性腦卒中的形成、發(fā)展以及預(yù)后的關(guān)系已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在正常狀態(tài)下，MMPs的活性被控制在較低水平；但在生理及病理?xiàng)l件下，MMPs過(guò)度激活，使細(xì)胞外基質(zhì)降解并且導(dǎo)致外周血管損傷[16]。MMP-2、MMP-9的激活促使血腦屏障開(kāi)放，引起血腦屏障的通透性增加。

腦卒中患者和大鼠局灶性腦缺血模型中，MMPs表達(dá)都顯著增加[17]。周進(jìn)研究顯示，MMP-2在缺血再灌注大鼠腦中表達(dá)上調(diào)，并與再灌注早期血腦屏障的開(kāi)放及后期組織修復(fù)即血管生成有關(guān)[18]。Asahi等研究顯示，腦缺血模型MMP-9表達(dá)明顯增加；而敲除MMP-9基因能減輕腦梗死過(guò)程中的腦損傷，顯著減少腦梗死區(qū)面積，具有腦保護(hù)作用[19]。MMP-9在腦缺血發(fā)作24 h至數(shù)月內(nèi)被激活，而MMP-2激活由于需要TLMP-2的參與，一般在腦缺血后2～5 d表達(dá)增加[15]。

本研究顯示，腦缺血再灌注損傷后3 d，缺血側(cè)皮層梗死周邊區(qū)MMP-2和MMP-9表達(dá)均上調(diào)，與已有報(bào)道一致[20-21]。表明MMPs在缺血性腦卒中發(fā)病早期參與到腦缺血損傷的病理機(jī)制中，并在時(shí)間順序上反映出MMPs的合成在神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性死亡中的重要

作用。給予莫諾苷治療后，MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯降低。我們推測(cè)，莫諾苷在腦卒中后早期的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制之一可能是下調(diào)MMPs。

莫諾苷對(duì)MMPs的作用可能不同于MMPs抑制劑。嚙齒類腦缺血模型研究表明，由于MMPs與血管形成有關(guān)，因此MMPs抑制劑會(huì)阻斷或減慢腦卒中后神經(jīng)修復(fù)，其保護(hù)作用在缺血后48 h失效[22]。

[1]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(5): 399-415.

[2]Moskowitz MA,Lo EH,Iadecola C.The science of stroke: mechanisms in search of treatments[J].Neuron,2010,67(2): 181-198.

[3]Arai K,Lok J,Guo S,et al.Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke[J].J Child Neurol,2011, 26(9):1193-1198.

[4]Zlokovic BV.The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders[J].Neuron,2008,57(2):178-201.

[5]Marchi N,Fazio V,Cucullo L,et al.Serum transthyretin monomer as a possible marker of blood-to-CSF barrier disruption[J].J Neurosci,2003,23(5):1949-1955.

[6]鄒偉,孫曉偉,于學(xué)平,等.血腦屏障與腦缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(3):466-468.

[7]張宇玲,蔡文杰.腦缺血再灌注動(dòng)物模型的血腦屏障損傷[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(15):2848-2850.

[8]Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases[J].Lancet Neurol,2009,8 (2):205-216.

[9]吳旭東,曹小定.血腦屏障與腦缺血[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè),2000,8(5):272-275.

[10]張毅,徐群,蘇敏,等.缺血性腦卒中患者急性期血漿中基質(zhì)金屬蛋白酶-9含量的動(dòng)態(tài)變化[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2003,11 (4):226-227.

[11]Wang W,Huang W,Li L,et al.Morroniside prevents peroxide-induced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28 (2):293-305.

[12]Wang W,Sun F,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2009,613(1-3):19-23.

[13]Wang W,Xu J,Li L,et al.Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats[J].Brain Res Bull, 2010,83(5):196-201.

[14]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[15]Gasche Y,Copin JC,Sugawara T,et al.Matrix metalloproteinase inhibition prevents oxidative stress-associated blood-brain barrier disruption after transient focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21(12):1393-1400.

[16]張法永,陳銜城,任惠民,等.缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血血腦屏障通透性和MMP-9表達(dá)的影響[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2001, 28(3):216-219.

[17]Rosell A,Ortega-Aznar A,Alvarez-Sabín J,et al.Increased brain expression of matrix metalloproteinase-9 after ischemic and hemorrhagic human stroke[J].Stroke,2006,37(6): 1399-1406.

[18]周進(jìn).MMP-2及MMP-9在缺血再灌注大鼠腦中的表達(dá)及意義[J].遼寧醫(yī)學(xué)雜志,2005,19(4):175-176.

[19]Asahi M,Wang X,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock out on proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia[J].J Neurosci,2001,21(19):7724-7732.

[20]Yang Y,Thompson JF,Taheri S,et al.Early inhibition of MMP activity in ischemic rat brain promotes expression of tight junction proteins and angiogenesis during recovery[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33(7):1104-1114.

[21]Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2): 104-112.

[22]Nag S,Manias JL,Stewart DJ.Pathology and new players in the pathogenesis of brain edema[J].Acta Neuropathol,2009, 118(2):197-217.

Effects of Morroniside on Expression of Matrix Metalloproteinases in Peri-infarct Cortex after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

HOU Hong-li,SUN Fang-ling,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China

Objective To study the effects of morroniside on the expression of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after cerebral ischemia-reperfusion.Methods 15 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=3),ischemia group(n=3),and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=3).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused.Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg 3 hours after operation.The expression of MMP-2 and MMP-9 in peri-infarct cortex were detected with immunohistochemistry staining 3 days after operation.Results The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and it decreased in all the morroniside groups compared with the ischemia group(P＜0.01).Conclusion Morroniside could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after ischemia,suggesting protecting the function of blood-brain barrier from ischemia.

cerebral ischemia-reperfusion;morroniside;matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.002

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0005-04

2014-09-09

2014-09-24)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX09102201-016)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173575；No.81373994)；3.北京市教委科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(No.112219)；4.北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011-3-097)。

1.河北北方學(xué)院，河北張家口市075000；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市100053。作者簡(jiǎn)介：侯虹麗(1986-)，女，漢族，山西交城縣人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)藥理，中藥藥理。通訊作者：王文。E-mail:lzwwang@163.com。