兔源金黃色葡萄球菌的分離鑒定

姜常青趙永峰刁非非韓鎧懌謝之景*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東 泰安 271018 ②山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 泰安）

兔源金黃色葡萄球菌的分離鑒定

姜常青①②趙永峰①②刁非非①②韓鎧懌①②謝之景①②*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東 泰安 271018 ②山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 泰安）

本研究采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)與16S rDNA測(cè)序等技術(shù)，對(duì)泰安某兔場(chǎng)病兔的肺組織進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定。結(jié)果表明，所分離細(xì)菌為無(wú)鞭毛、無(wú)莢膜、無(wú)芽胞的革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌，能分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，16S rDNA序列同源性與金黃色葡萄球菌的同源性超過(guò)99%。所分離細(xì)菌為金黃色葡萄球菌，對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、慶大霉素等敏感性高，對(duì)新霉素、四環(huán)素中度敏感，對(duì)多粘菌素B、磺胺甲噁唑具有耐藥性。

金黃色葡萄球菌 藥敏試驗(yàn) 生化試驗(yàn) 16S rDNA

泰安某兔場(chǎng)于2015年5～6月爆發(fā)一種以呼吸道癥狀為主的疾病，患病兔流鼻涕、噴嚏、咳嗽，嚴(yán)重者流膿性鼻液，采食量長(zhǎng)期低于正常水平，兔消瘦，被毛粗糙。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)是一種條件性人畜共患病原菌。廣泛存在于自然界以及人、動(dòng)物皮膚、鼻咽部黏膜及腸道內(nèi)，當(dāng)機(jī)體的抵抗力下降或皮膚黏膜破損時(shí)，病菌便可乘虛而入，大量生長(zhǎng)繁殖，不僅可引起人的局部毛囊炎、蜂窩織炎、肺炎、心包炎外，還可引起仔豬滲出性皮炎、豬心膜炎、奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎等多種動(dòng)物的疾病，若治療不及時(shí)，常引起敗血癥而死(張克紅等，2009)。兔葡萄球菌病是由金黃色葡萄球菌感染引起，主要表現(xiàn)為兔致死性傳染病和全身各器官膿腫，有的死兔出現(xiàn)肝臟腫大，有明顯的壞死灶，膽囊腫大，膽汁濃稠，脾臟腫大(徐海風(fēng)等，2008)。仔兔小腸黏膜充血、出血、腔積液、膀胱極度擴(kuò)張，充滿橙黃色尿液而成兔也會(huì)發(fā)生黃尿病(高云航等，2009)。臨床表現(xiàn)為消瘦、精神沉郁，伴有腹瀉，一年四季均可發(fā)生，尤以氣候溫暖和潮濕季節(jié)多發(fā)(陸承平，2010；Franklin等，1998；Silvija等，1998)。本試驗(yàn)對(duì)泰安某兔場(chǎng)的疑是兔金黃色葡萄球菌病病例進(jìn)行了病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，為該病的防治提供了數(shù)據(jù)。

1 研究方法

1.1 病料 山東泰安某兔場(chǎng)送檢的患病兔。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 用燒紅的手術(shù)刀片對(duì)病兔的肺臟表面進(jìn)行燒烙，用無(wú)菌剪刀在燒烙表面剪開(kāi)一個(gè)切口，將接種環(huán)深入切口內(nèi)取樣，分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和血平板上(培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況和菌落特征，并挑選典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 選取干凈的載玻片，挑取血平板上菌落，用接種環(huán)挑取少量涂于載玻片上，混合一鉑耳生理鹽水，在載玻片上均勻涂抹，自然干燥后在酒精燈火焰上固定，采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.4 生化試驗(yàn) 挑單個(gè)菌落進(jìn)行觸酶試驗(yàn)(何志光等2010)。挑取典型菌落接種到葡萄球菌生化鑒定系統(tǒng)的各生化管中，進(jìn)行生化鑒定。37℃培養(yǎng)24～48h，觀察顏色變化。

1.5 藥敏試驗(yàn) 挑取典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，于超凈臺(tái)中無(wú)菌操作取0.1ml菌液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布棒涂抹均勻后，按照國(guó)標(biāo)要求，每種藥敏片之間距離適當(dāng)(購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)。37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.6 16S rDNA基因序列測(cè)定 將純化的分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，28℃培養(yǎng)18 h后，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取分離株的基因組DNA。細(xì)菌16S rDNA通用引物：P1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, P2: 5'-GGTTACCTTGT TACGACTT-3'(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，預(yù)期擴(kuò)增片段約為1450bp。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 5μl，10×PCR buffer 5μl，2.5mmol/μl dNTPs 2μl，引物各1μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，用ddH2O調(diào)整終體積至50μl。反應(yīng)條件：94℃ 5min預(yù)變性；94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后交由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。使用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài) 所分離細(xì)菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤(rùn)、隆起的邊緣整齊、不透明、直徑1～2mm、有黃色色素的圓形菌落(圖1)；在血平板形成較大的圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色菌落，菌落周?chē)纬赏耆该鳓氯苎h(huán)(圖2)。

2.2 菌體形態(tài) 挑取菌落，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性呈葡萄狀排列的球菌，與金黃色葡萄球菌的染色特性一致(圖3)。

2.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析結(jié)果 所分離細(xì)菌擴(kuò)增出1500bp左右的片段，與預(yù)期(1450bp)一致(圖4)；用

DNAStar軟件對(duì)序列分析結(jié)果表明其與金黃色葡萄球菌的同源性超過(guò)99%。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 在血平板上的菌落特征

圖3 分離菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

圖4 16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所分離菌株能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，蔗糖不確定；硫化氫、尿素酶、氰化鉀陰性；三糖鐵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，硫化氫陰性，符合金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果(表1)。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 所分離菌株對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、慶大霉素等敏感性高，對(duì)新霉素、四環(huán)素中度敏感，對(duì)多粘菌素B、磺胺甲噁唑具有耐藥性(表2)。

表2 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

3 討論

（1）金黃色葡萄球菌是一種重要人畜共患病原菌，是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染，在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。其致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。該均對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.5～1.0mm。血平板菌落周?chē)纬赏该鞯娜苎h(huán)。在該研究，所分離細(xì)菌具有金黃色葡萄球菌的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性，并且生化特性與金黃色葡萄球菌一致。16S rDNA是編碼原核生物16S rDNA的基因，由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，無(wú)顯著差異；可變區(qū)具有細(xì)菌種、屬特異性(劉朝軍，2011)。因此，16S rDNA已成為細(xì)菌鑒別與分類(lèi)研究中較理想的靶序列(Sontakke et al.,2009)。本研究在傳統(tǒng)的細(xì)菌理化特性鑒定的基礎(chǔ)上，利用16S rDNA擴(kuò)增及序列分析法對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。所分離細(xì)菌的16S rDNA與金黃色葡萄球菌的同源性超過(guò)99%，進(jìn)一步證明所分離細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。（2）從臨床癥狀、剖解變化及對(duì)病兔臟器的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、16srRNA的序列分析，確定該兔場(chǎng)爆發(fā)的疾病是由金黃色葡萄球菌感染所引起。所分離菌株對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、慶大霉素等敏感性高，對(duì)新霉素、四環(huán)素中度敏感，對(duì)多粘菌素B、磺胺甲噁唑具有耐藥性。（3）在生產(chǎn)中，葡萄球菌感染兔引起肺炎的現(xiàn)象比較少見(jiàn)，所以應(yīng)引起養(yǎng)兔從業(yè)者和獸醫(yī)工作者的重視。我們?cè)诮窈蟮难芯恐校瑢⒗^續(xù)進(jìn)行兔葡萄球菌性肺炎的流行病學(xué)調(diào)查，并深入研究兔葡萄球菌性肺炎的致病機(jī)理，為該病的防控提供理論支撐。

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2015–07–02）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-18-011-07)。

*通訊作者