原發(fā)性肝癌TACE對外周血髓源性免疫抑制細(xì)胞百分比的影響

邵明亮，張巍，苗同國，閆會敏，吳宗耀

(1.石家莊市第五醫(yī)院 介入醫(yī)學(xué)科，石家莊 050021；2.石家莊市第五醫(yī)院 肝病研究所，石家莊 050021；3.西藏藏醫(yī)藥大學(xué) 藏醫(yī)藥研究所，西藏 850000)

HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HBV-related hepatocellular carcinoma)的早期診斷困難，病情進(jìn)展快，易復(fù)發(fā)，每年導(dǎo)致超過100萬人死亡，是致死率非常高的腫瘤之一[1]。目前肝癌的治療主要以肝臟局部切除、射頻消融和肝臟移植等為根治手段，由于大部分患者在接受治療時已處于肝癌中晚期，只有不到30%的患者有根治性治療適應(yīng)癥。經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization， TACE)為非手術(shù)治療適應(yīng)癥患者的首選療法。髓源性免疫抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell， MDSC)是由骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓系細(xì)胞(immature myeloid cell， IMC)組成的異質(zhì)細(xì)胞群，正常生理?xiàng)l件下后者會進(jìn)一步發(fā)育為成熟的單核系、粒系血細(xì)胞及DC。MDSC具有強(qiáng)大而廣譜的免疫抑制功能，在體外能顯著抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群增殖，促進(jìn)Treg活化，干擾T細(xì)胞的遷移和活性，生成氧化應(yīng)激產(chǎn)物等[2]。在腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病等病理?xiàng)l件下，MDSC通過抑制GM-CSF、IL-17及TNF-α分泌，阻斷IMC分化，抑制炎癥反應(yīng)而顯著促進(jìn)小鼠在體腫瘤的生長[3]。本研究旨在分析肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、治療等是否與MDSC百分比有關(guān)，及其可能的疾病相關(guān)預(yù)測作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2011年5月—2015年1月于石家莊市第五醫(yī)院就診的HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者237例，患者年齡(59.36±6.57)歲，年齡范圍30～77 歲，經(jīng)病理診斷確診為肝細(xì)胞肝癌，患者的具體信息如下(表1)。

表1 入組對象一般資料

所有患者的診斷均符合原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)[4]，腫瘤分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2002年修訂的肝癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者有HBV感染史；(2)經(jīng)2種影像學(xué)手段(CT、MRI、超聲造影等)證實(shí)或有病理檢查證實(shí)；(3)所有患者6個月內(nèi)均未接受過任何抗腫瘤治療，且患者對研究知情并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非原發(fā)性肝癌，如肉瘤、惡性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性肝癌等患者；(2)不能配合完成隨訪者。

1.2 試劑與儀器人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；FBS，購自Gibco公司；兔抗人單克隆熒光抗體CD33-PE，購自BioLegend公司；兔抗人CD11b/Mac-1-APC、HLA-DR-PE-Cy7、CD15-PerCP-Cy5.5、CD14-FITC、CD3-FITC、CD4-PE-Cy5、CD8-PE-Cy7同型對照抗體，購自BD公司；HBV-DNA實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，購自上海羅氏制藥有限公司；HBVe抗原診斷試劑盒(ELISA)，購自上海科華生物工程股份有限公司；AFP化學(xué)發(fā)光法(CMIA)試劑盒，購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)，來自Eppendorf公司；BD FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀，來自BD公司。

1.3 PBMC的分離及抗體標(biāo)記分別于TACE術(shù)前以及術(shù)后6個月采集患者靜脈血10 mL于EDTA抗凝管。用PBS稀釋細(xì)胞沉淀至18 mL，均分為2管。向潔凈EP管中加入Ficoll液4.5 mL，按1∶2比例將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢加至Ficoll液面上方；800×g離心20 min，分離后液面上方第2層白色薄層液體即為粗分PBMC。吸取100 μL細(xì)胞懸液于流式管中，分別加入單克隆抗體抗CD33-PE、CD11b/Mac-1-APC、HLA-DR-PE-Cy7、CD14-FITC、CD15-PerCP-Cy5.5 各20 μL；對照管中加入相應(yīng)的同型對照抗體用于排除非特異性染色干擾?；靹蚣?xì)胞及抗體混懸液，置于冰上避光孵育30 min后250×g離心6 min。棄去上清液，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測G-MDSC(CD33+/CD15+/HLA-DRlow/CD11b+)占PBMC的百分比。

1.4 腫瘤患者HBV及肝癌相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測分別進(jìn)行乙肝e抗原定量(HBeAg、HBeAb)和HBV DNA載量檢測，檢測靈敏度>500 IU/L,AFP檢測下限7 ng/mL,Child-Pugh評分標(biāo)準(zhǔn)如下(表2), 以總分≤6分為A級，7～9分為B級，≥10分為C級。

表2 肝功能的Child-Pugh評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 肝癌患者的CT檢查依據(jù)影像學(xué)特點(diǎn)判斷肝癌單發(fā)、多發(fā)，測量腫瘤長短徑及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。CT分為平掃期、動脈期、靜脈期和延遲期4期掃描檢查。肝癌CT增強(qiáng)圖像可見：肝臟占位在動脈期出現(xiàn)快速不均質(zhì)血管強(qiáng)化，密度高于正常肝組織；而靜脈期或延遲期造影劑被快速洗脫，病灶密度低于周圍正常肝組織。腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移CT增強(qiáng)圖像可見：門靜脈主干、分支的粗細(xì)不成比例，血管內(nèi)可見充盈缺損。

1.6 肝癌患者的TACE治療TACE治療患者擺平臥位，消毒后取右側(cè)腹股溝韌帶下1.5 cm股動脈搏動最明顯處為穿刺點(diǎn)，用2%利多卡因5 mL局部麻醉。分析病灶數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography, DSA)表現(xiàn)，明確腫瘤的部位、大小、數(shù)量及供血動脈后，將導(dǎo)管介入至肝固有動脈或肝右、左動脈支進(jìn)行局部灌注化療，灌注時間不應(yīng)少于15～20 min。將碘化油與化療藥物(絲裂霉素10 mg、表柔比星40 mg)充分混合成乳劑，經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入，通常總注射劑量為10 mL。腫瘤呈乏血供時的碘化油用量減少至5 mL。如有肝動脈-門靜脈瘺和/或肝動脈-肝靜脈瘺，可先用明膠海綿或不銹鋼圈堵塞瘺口，再將適量碘化油緩慢注入。注射完成后拔出導(dǎo)管及導(dǎo)管鞘，壓迫止血15 min，加壓包扎。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者的基本情況從患者的基線資料可以看出，男性、農(nóng)民、有肝癌家族史患者為研究的主要對象；經(jīng)統(tǒng)計(jì)樣本中肝癌患者臨床特征包括BCLC分期為A、B期，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，無門靜脈瘤栓等(表3)。

表3 肝癌患者的基本情況

2.2 肝癌患者臨床特征與MDSC百分比單因素分析不同性別、年齡、家族史、腫瘤長徑、數(shù)量、有無門靜脈瘤栓患者的MDSC百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05, 表4)。Child-Pugh B組(14.29%)高于 A組(8.16%)； 肝硬化失代償期(16.87%)高于代償期(9.63%)；HBV DNA載量≥103組(14.92%)高于HBV DNA<103組(6.73%)；HBeAg(+)組(20.47%)高于HBeAg(-)組(13.63%)；BCLC分期B組(22.03%)高于分期A組(14.12%)；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組(21.03%)高于無轉(zhuǎn)移組(5.10%)；血管侵犯組(26.15%)高于無血管侵犯組(7.38%)； 非TACE治療組(34.00%)高于TACE治療組(25.90%)。(均P<0.05， 表4、 圖1和圖2)

圖1 肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組患者G-MDSC(CD33 +/CD15+/HLA-DRlow/CD11b+)FACS檢測結(jié)果

圖2 不同臨床特征肝癌患者M(jìn)DSC百分比FACS檢測結(jié)果

表4 237例肝癌患者臨床特征的單因素分析

2.3 利用Cox回歸模型對影響肝癌患者M(jìn)DSC百分比因素的多因素分析經(jīng)單因素分析篩選出8個臨床因素，對其進(jìn)行多因素分析后發(fā)現(xiàn)，BCLC分期、治療方式是顯著影響MDSC百分比的因素(均P<0.01，表5)。

表5 Cox回歸模型分析肝癌患者主要臨床特征對MDSC百分比的影響

2.4 MDSC百分比對肝癌TACE治療復(fù)發(fā)診斷的效能分析依據(jù)上述MDSC百分比結(jié)果的差異，比較不同水平MDSC百分比對肝癌TACE治療后復(fù)發(fā)診斷的效能，發(fā)現(xiàn)MDSC(24.21%)的診斷靈敏度(81.64%)和特異度(73.56%)最高，準(zhǔn)確度(65.70%)較高，適用于下一步研究(表6)。

表6 MDSC百分比對肝癌患者TACE治療后復(fù)發(fā)診斷的效能

2.5 Kaplan-Meier分析MDSC百分比對肝癌患者TACE后生存率的影響進(jìn)一步依據(jù)MDSC百分比(24.21%)對接受TACE的124例患者生存率進(jìn)行為期24個月的觀察，發(fā)現(xiàn)MDSC%≥24.21%組平均無進(jìn)展生存期(8.31個月)與<24.21%組(16.72個月)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表7、 圖3)。

圖3 TACE和非TACE組患者的Kaplan-Meier生存曲線分析

表7 Kaplan-Meier分析MDSC百分比對肝癌患者TACE治療后生存率的影響

3 討論

肝炎病毒是誘發(fā)肝癌的最重要因素，其中HBV繼發(fā)肝癌者約占患者總數(shù)的90%，HCV相關(guān)肝癌占10%；大約70%的肝硬化患者會進(jìn)一步發(fā)展成肝細(xì)胞癌[4]。HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生過程中脾臟功能異常導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂?；颊唧w內(nèi)免疫抑制細(xì)胞Treg、MDSC、免疫檢查點(diǎn)分子(PD-1)及抑制性細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，CD4+、CD8+T細(xì)胞、NK、DC、Th17耗竭，IFN-γ、IL-10、TGF-β1及顆粒酶B分泌水平降低[5]。

MDSC的免疫調(diào)節(jié)功能非?；钴S[6-7]，有研究顯示，肝細(xì)胞癌患者中CD14+HLA-DRlowMDSC百分比相比肝硬化患者明顯升高[7]。疾病早期MDSC破壞腫瘤細(xì)胞增殖微環(huán)境，激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)以發(fā)揮抗腫瘤作用。而進(jìn)展期腫瘤微環(huán)境則轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤免疫抑制狀態(tài)，MDSC分泌大量促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的GM-CSF促進(jìn)腫瘤免疫逃逸過程。MDSC可以通過免疫相關(guān)機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移以及局部浸潤[8-10]。

本研究顯示，肝癌患者臨床分期BCLC B期MDSC百分比高于A期，同時肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組MDSC百分比高于無轉(zhuǎn)移組，血管侵犯時MDSC百分比顯著提高，提示患者病情越重，MDSC百分比越高，與臨床進(jìn)展、不良預(yù)后、低生存率有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，非TACE組MDSC百分比顯著高于TACE組，而TACE可以顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，提示MDSC百分比上調(diào)與肝癌細(xì)胞增殖、病情進(jìn)展有關(guān)。相關(guān)研究證實(shí)，TACE可以抑制肝癌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的激活[11-12]，MDSC增殖與PI3K家族信號通路相關(guān)[13]。由此推測非TACE治療導(dǎo)致肝癌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路過度激活，誘導(dǎo)MDSC增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，瘤栓組MDSC百分比高于非瘤栓組，由此推測腫瘤瘤栓通過刺激免疫細(xì)胞分泌免疫因子，誘導(dǎo)機(jī)體生成并活化MDSC。Hwang等[14]研究證實(shí)了MDSC與PI3K/AKT信號通路有關(guān)——PI3K/AKT信號通路激活了髓樣前體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子c-Rel， 后者進(jìn)入細(xì)胞核， 并與MDSC的特異標(biāo)志性基因(Cebpb或Arg1)的啟動子或增強(qiáng)子結(jié)合，形成啟動MDSC分化的特異性增強(qiáng)體(轉(zhuǎn)錄復(fù)合物)，從而誘導(dǎo)MDSC的產(chǎn)生。MDSC促進(jìn)腫瘤侵襲的作用依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)。MDSC表達(dá)MMP家族蛋白酶促進(jìn)腫瘤微環(huán)境血管新生以及髓系造血細(xì)胞動員，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。通過多因素分析初步確定影響MDSC百分比的主要因素為BCLC分期以及治療方式，提示進(jìn)一步研究以MDSC功能調(diào)節(jié)為腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價值。MDSC通過合成蛋白水解酶，加快細(xì)胞外基質(zhì)水解，使毛細(xì)血管通透性增加，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸潤[15]。因此，筆者推測腫瘤細(xì)胞和MDSC之間的調(diào)控是一個相互反饋的作用過程。

國內(nèi)研究顯示，對肝癌組患者進(jìn)行短期隨訪觀察后發(fā)現(xiàn)，外周血MDSC百分比與患者術(shù)后生存率有關(guān)，可作為預(yù)測該類患者病死率的潛在指標(biāo)[16]。國內(nèi)同類研究也表明肝細(xì)胞癌患者外周血中MDSC的增殖與其腫瘤臨床病理情況有關(guān)，腫瘤組織局部MDSC數(shù)量高于外周血。本研究證實(shí)MDSC能夠顯著影響患者的TACE術(shù)后生存率，MDSC百分比越高，患者生存率越低，提示以MDSC為監(jiān)測對象初步預(yù)測患者術(shù)后康復(fù)情況具有積極的臨床意義。

綜上所述，肝癌患者M(jìn)DSC百分比與BCLC分期以及TACE治療有關(guān)， 其監(jiān)測有助于預(yù)測肝癌的臨床進(jìn)展。