親和體分子在影像、治療和生物技術(shù)中的應(yīng)用

王樂丹 張麗芳

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親和體分子在影像、治療和生物技術(shù)中的應(yīng)用

王樂丹 張麗芳

親和體(affibody)分子由58個氨基酸組成，蛋白相對分子質(zhì)量約為6.5kDa，其來自于金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)B結(jié)構(gòu)域。含有3個α螺旋結(jié)構(gòu)，其中該親和體分子的第1及第2螺旋中含有13個特定位點(diǎn)的氨基酸，并且這些氨基酸可隨機(jī)突變，對其結(jié)構(gòu)無明顯影響，形成可以與任何分子結(jié)合的親和體文庫。親和體的功能和抗體類似，但也有一些性質(zhì)是抗體所沒有的：如相對分子質(zhì)量小、高親和力、折疊速率快、理化性能穩(wěn)定、能經(jīng)受受化學(xué)修飾等特點(diǎn)，因此有人稱其為“人工抗體”，在治療、診斷和生物技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。

親和體 治療 診斷 生物技術(shù)

親和體(affibody)是一種衍生于葡萄球菌A 蛋白Z 結(jié)構(gòu)域的人工蛋白質(zhì)分子。為單鏈結(jié)構(gòu)，由58 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為6.5kDa，形成3 個α 螺旋結(jié)構(gòu)，其中第1及第2螺旋中的13 個特定位點(diǎn)的氨基酸對其結(jié)構(gòu)無明顯影響，分別是Q9(谷氨酰胺)、Q10(谷氨酰胺)、N11(天冬酰胺)、F13(苯丙氨酸)、Y14(酪氨酸)、L17(亮氨酸)、H18(組氨酸)、E24(谷氨酸)、E25(谷氨酸)、R27(精氨酸)、N28(天冬酰胺)、Q32(谷氨酰胺)、K35(賴氨酸)，用簡并密碼子NNK(K=G 或者T，包含32 種密碼子，囊括了20 種氨基酸)替換這13 個氨基酸的密碼子，形成很多轉(zhuǎn)化體，理論上包含3213個基因序列和2013個氨基酸序列，這些轉(zhuǎn)化體也就組成了affibody文庫，用該文庫對靶標(biāo)進(jìn)行篩選，可獲得能與靶標(biāo)特異結(jié)合的親和體[1]。

篩選獲得的親和體與靶分子的結(jié)合與抗體和抗原的結(jié)合特性相似，但與抗體相比，又具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢，如：獲得方法簡便，通過體外篩選即可獲得；容易制備，以化學(xué)合成方法或原核表達(dá)即可大量制備；同時因為其分子質(zhì)量小，在生物體內(nèi)組織穿透性強(qiáng)，并且通過血液后，血漿清除率高，而且親和體分子理化性質(zhì)穩(wěn)定，可以通過將其交聯(lián)或融合表達(dá)與標(biāo)記分子(如熒光蛋白、生物素等)結(jié)合而不影響其與靶分子的結(jié)合能力，基于以上這些特性，親和體有望作為抗體的替代品，用于蛋白質(zhì)識別、分離及純化、實(shí)驗診斷、分子顯像及靶向治療等[2]。在本文中，我們將回顧親和體分子作為一種可行的，有時甚至比抗體更好的替代品，在治療、體內(nèi)成像和生物技術(shù)中的應(yīng)用。

一、親和體的展示方法

親和體的展示方法包括噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、細(xì)胞展示技術(shù)及蛋白質(zhì)互補(bǔ)分析技術(shù)等，其中以噬菌體展示技術(shù)最為常見。

噬菌體展示技術(shù)是以改造的噬菌體為載體，在噬菌體外殼蛋白基因區(qū)定向插入待選的基因片段，使噬菌體表面能展示這些外源多肽或表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過多次淘洗的方法，進(jìn)一步富集表達(dá)有這些多肽或蛋白質(zhì)的噬菌體，從而得到具有特異性結(jié)合的多肽或蛋白質(zhì)的一種生物學(xué)技術(shù)[3]。噬菌體展示技術(shù)最大的特點(diǎn)，是基因型能直接反映表達(dá)型，而且在噬菌體表面展示的外源多肽或蛋白質(zhì)不影響噬菌體的天然構(gòu)型及生活周期。目前這項技術(shù)已經(jīng)成功篩選了Aβ、EGFR、 HER-2等多種靶蛋白親和體。

核糖體展示技術(shù)(ribosome display technology, RDT)是一種利用功能性蛋白間相互作用而進(jìn)行篩選的新技術(shù)，它是在多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。最早由Plückthun 實(shí)驗室首先提出，他們將折疊正確的蛋白及其相應(yīng) mRNA同時結(jié)合在核糖體上， 形成蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA的三聚體，使目的蛋白的表型和基因型聯(lián)系起來，常用于抗體及蛋白質(zhì)文庫的選擇、蛋白質(zhì)體外改造等[4]。

親和體文庫也可以直接展示在細(xì)胞表面，細(xì)胞展示和噬菌體展示類似，但細(xì)胞比噬菌體大，可使用定量流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行文庫排序和篩選后的鑒定[5]。有研究人員將親和體文庫在革蘭陽性細(xì)菌肉葡萄球菌中表達(dá)并且展示在細(xì)胞表面，進(jìn)行TNF-α親和體的篩選。新近發(fā)展起來的另一個篩選方法是蛋白質(zhì)互補(bǔ)分析(PCA)，它通常用于研究天然蛋白質(zhì)間相互作用。相比其他展示系統(tǒng)，這種方法的靶標(biāo)是在細(xì)胞內(nèi)，從而避免了靶蛋白的生產(chǎn)和純化過程[6]。另外，由于 PCA是通過介質(zhì)中存活克隆來篩選陽性克隆，故可以通過簡單的培養(yǎng)完成特異親和體的篩選。

二、親和體的應(yīng)用

1.在影像學(xué)中的應(yīng)用:在目前常規(guī)臨床實(shí)踐中，重要的診斷手段有解剖成像，例如計算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)，也有分子水平上功能性或分子成像，如單光子發(fā)射光譜儀(SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)。分子成像研究中的絕大部分是使用葡萄糖類似物進(jìn)行的2 - [18F]氟-2 - 脫氧-D-葡萄糖(18F-FDG PET)，其對檢測轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性疾病及其有用[7]。然而，18F-FDG PET的結(jié)果是非特異性的，不能鑒別癌細(xì)胞表面特異性受體，如人表皮生長因子受體2(HER-2)，因此不能用于靶向治療。理想的成像劑應(yīng)具有特異性和親和性。此外，快速的生物分布和組織滲透，使局部濃度富集，以及未結(jié)合示蹤劑快速清除，從而形成高對比度的腫瘤成像[8]。最近的研究表明，親和體分子具有最佳示蹤劑的特性，在HER-2特異性分子成像中，親和體分子可以在給藥后的第1個小時內(nèi)找到并結(jié)合到靶標(biāo)，而且未結(jié)合部分血液清除率快。

親和體分子的第1例特異性放射性標(biāo)記是Orlova[9]報道的。在這項研究中，親和體分子ZHER-2：342是通過合成制備的肽，將具有DOTA的一個化學(xué)過程耦合到N末端，得到DOTA-ZHER-2：342-PEP2(ABY-002)。 ABY-002是有效的，穩(wěn)定的溫度為60～90℃。111In - ABY-002在SKOV-3荷瘤小鼠體內(nèi)的分布顯示，注射后1h有效的腫瘤吸收了23%ID/g，腫瘤血液比值(T/B)的1h后為12，4h達(dá)到120。在所有時間點(diǎn)，除腎臟外，腫瘤攝取比所有其他器官的攝取高?？焖俳档脱褐械姆派湫苑e累，在尿液中顯示快速清除，其主要由腎小球濾過。111In - ABY-002的快速動力學(xué)允許HER-2過度表達(dá)的腫瘤在注射后1h可視化。 雙標(biāo)記實(shí)驗，即在小鼠異種移植模型中共注射68Ga-和親和體分子與兩個不同的放射性金屬標(biāo)記，一是伽馬發(fā)射器和一個正電子發(fā)射體。結(jié)果顯示相似的腫瘤同時攝取兩種分子。然而，68Ga-ABY-002在血液、肺、脾的放射強(qiáng)度比111In- ABY-002 顯著低。因此，圖像的對比度是68Ga-ABY-002 PET圖像比111In - ABY-002略勝一籌。近日，HER-2靶向親和體被連接到超順磁性氧化鐵顆粒對腫瘤進(jìn)行靶向造影，結(jié)果在腫瘤部位可見帶有親和體親和性的超順磁性氧化鐵顆粒信號。實(shí)驗證明，親和體分子可以帶有大量的各種放射性核素，因此親和體用做SPECT或PET示蹤劑是可能的[10]。

2.在靶向治療的應(yīng)用:親和體分子在影像學(xué)中的應(yīng)用，其實(shí)是通過將放射性核素作為它的有效負(fù)載來實(shí)現(xiàn)的，如果選用治療腫瘤的藥物替代放射性核素來充當(dāng)親和體分子的負(fù)載，那么通過連接親和體分子和抗腫瘤藥物，或者載有抗腫瘤藥物的給藥系統(tǒng)，就可實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療。目前親和體分子在藥物載體方面的應(yīng)用大多是將親和體分子連接到納米粒表面，納米粒是由高分子材料制備的具有“核-殼結(jié)構(gòu)”的材料，通過親和體的特異性和親和性，使納米粒達(dá)到靶向的功能[11]。Alexis 等[12]將親和體分子Cys-ZHER-2:342偶聯(lián)到納米粒表面，制備了靶向納米粒，同時設(shè)置非靶向納米粒為對照，用SKBR-3 和SKOV-3 兩個細(xì)胞系來評估它們的外攝取和細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞系中靶向納米粒組的細(xì)胞攝取率和殺傷活性均優(yōu)于非靶向納米粒組，說明其制備的靶向納米粒具有應(yīng)用前景。

也有研究者通過基因重組技術(shù)將毒素的編碼基因與親和體分子進(jìn)行克隆融合重組，經(jīng)在體外細(xì)菌中表達(dá)、純化, 制備出免疫毒素，以親和體作為導(dǎo)向分子, 將毒素靶向癌細(xì)胞, 達(dá)到治療的目的。最新研究表明，Zielinski等[13]在HER-2的高特異性高親和體分子上融合免疫毒性蛋白PE38，制備了HER-2的高親和的毒性分子親和體，按照0.25mg/kg的劑量尾靜脈注射于接種了HER-2高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的腫瘤模型裸鼠，連續(xù)注射6次，30天后腫瘤消失。于脂質(zhì)體雙層插入HER-2特異性的親和體分子也可靶向殺傷HER-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，從而提高治療效果和安全效果。這些為腫瘤的治療提供了更為有效的新的治療手段。

3.在生物技術(shù)中的應(yīng)用：由于親和體分子具有和抗體相似的親和性，而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分子質(zhì)量小，故已被廣泛地用于抗體的生物分離，如親和層析、免疫沉淀等生物技術(shù)。目前， 親和體 AB公司與GE Healthcare公司一起研制親和體的改進(jìn)方式，如堿穩(wěn)定版本，為耐受性提高到堿處理再生在親和層析中。近來有研究表明，親和體分子在酶聯(lián)免疫吸附測定和免疫組化的應(yīng)用中也取得了相應(yīng)的進(jìn)展。Friedman 等[14]還用親和體分子作為熒光探針檢測細(xì)胞表面EGFR 和HER-2 受體的表達(dá)水平。有關(guān)ELISA設(shè)置中，親和體分子作為親和探針固定在蛋白質(zhì)微陣列。例如，在一項研究中將二聚體的親和體分子與IgA抗體，IgE抗體，IgG抗體，腫瘤壞死因子，胰島素和Taq聚合酶親和體，分別固定在硫醇葡聚糖微陣列載玻片，隨后孵化與熒光標(biāo)記的分析物，露出各自靶蛋白的特異性結(jié)合，而且沒有觀察到交叉反應(yīng)。

總之，親和體分子代表了一類新的親和性配體，由于其具有分子質(zhì)量小、結(jié)合力高、特異性強(qiáng)、靶向濃聚迅速、血液清除快等優(yōu)點(diǎn)，在過去的20年中，在成像、靶向治療和生物技術(shù)等方面得到了廣泛研究。目前已經(jīng)成功地用親和體分子診斷HER-2表達(dá)陽性的癌癥患者，而且也有將親和體分子作為IgG親和純化柱的親和配體，商業(yè)化后年銷售額達(dá)數(shù)千萬元。目前親和體分子的應(yīng)用領(lǐng)域日益廣泛，隨著更多親和體的開發(fā)，親和體有望替代抗體，完成目標(biāo)蛋白檢測、分離、腫瘤影像診斷及治療等作用。

1 Kronqvist N, Malm M, G?string L,etal. Combining phage and staphylococcal surface display for generation of ErbB3-specific Affibody molecules[J]. Protein Eng Des Sel,2011,24(4):385-396

2 Orlova A, Feldwisch J, Abrahmsén L,etal. Update: affibody molecules for molecular imaging and therapy for cancer[J]. Cancer Biother Radiopharm,2007,22(5):573-584

3 Pande J, Szewczyk MM, Grover AK. Phage display: concept, innovations, applications and future[J]. Biotechnol Adv, 2010, 28(6):849-858

4 Hanes J, Plückthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1997, 94(10): 4937-4942

5 Kronqvist N, Lofblom J, Jonsson A,etal.A novel affinity protein selection system based on staphylococcal cell surface display and flow cytometry[J].Protein Eng Des Sel,2008, 21(4): 247- 255

6 Koch H, Gr?fe N, Schiess R,etal. Direct selection of antibodies from complex libraries with the protein fragment complementation assay[J]. Journal of Molecular Biology, 2006, 357(2): 427-441

7 Brindle K. New approaches for imaging tumour responses to treatment[J]. Nat Rev Cancer 2008, 8(2): 94-107

8 Tolmachev V, Orlova A, Nilsson FY,etal. Affibody molecules: potential for in vivo imaging of molecular targets for cancer therapy[J]. Expert Opin Biol Ther, 2007,7(4): 555-568

9 Orlova A. Synthetic affibody molecules: a novel class of affinity ligands for molecular imaging of HER2-expressing malignant tumors[J]. Cancer Res, 2007, 67(5): 2178-2186

10 Gong H, Kovar J, Little G,etal. In vivo imaging of xenograft tumors using an epidermal growth factor receptor-specific affibody molecule labeled with a near-infrared fluorophore[J]. Neoplasia, 2010, 12(2): 139-149

11 Feldwisch J. Design of an optimized scaffold for affibody molecules[J]. J Mol Biol, 2010, 398 (2): 232-247

12 Alexis F，Basto P，Levy-Nissenbaum E，etal. HER-2-targeted nanoparticle-affibody bioconjugates for cancer therapy[J]. Chem Med Chem, 2008, 3(12)：1839-1843

13 Zielinski R, Lyakhov I, Hassan M,etal. HER2-affitoxin: a potent therapeutic agent for the treatment of HER2-overexpressing tumors[J]. Clinical Cancer Research, 2011, 17(15): 5071-5081

14 Friedman M，Lindstrom S，Ekerljung L，etal. Engineering and characterization of a bispecific HER2 x EGFR-binding affibody molecule[J]. Biotechnol Appl Biochem，2009，54(2)：121-131

(修回日期：2015-02-26)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81172463)；溫州市科技局基金資助項目(Y20140319)

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(王樂丹)； 325000 溫州醫(yī)科大學(xué)(張麗芳)

張麗芳，教授,博士生導(dǎo)師，電子信箱：zlf@wzmc.net

R392

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.005

2015-01-14)