抗壞血酸/谷氨酸Maillard 反應體系中間產(chǎn)物和褐變程度的研究

周永妍，李 亞，余愛農(nóng)

(湖北民族學院 化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施445000)

Maillard 反應是食品加工和儲藏過程中的羰基化合物(主要是還原糖類)與氨基化合物在一定溫度下發(fā)生的一系列非酶褐變反應，又稱為羧氨反應［1］．Maillard 反應是食品在加工和儲藏過程中最常發(fā)生的主要的反應之一，可生成易揮發(fā)的小分子［2］和棕色的大分子類物質類黑精［3］，從而影響食品的風味和色澤，因此被廣泛研究．

對經(jīng)典Maillard 反應的研究大多集中于還原糖與氨基酸的反應［4］，然而隨著還原糖研究的完善，人們將研究轉向能發(fā)生Maillard 反應的其他羰基化合物上［5］． 抗壞血酸是一種廣泛存在于植物性食品如水果蔬菜［6］以及動物食品如牛乳和肝中的羰基化合物．此外，在食品和飼料貯藏加工過程中，抗壞血酸也是一種常見的食品添加劑，具有較好的抗氧化性能．對基于抗壞血酸的Maillard 反應進行研究有利于人們更深入的了解食品的加工和儲藏過程，控制食品中的反應向人們期望的方向進行．

由于Maillard 反應極其復雜，產(chǎn)物種類繁多，因此分別進行細致的研究存在一定難度，但其很多性質與顏色的變化存在關系［7］，例如有關文獻提到Maillard 產(chǎn)物的抗氧化作用與顏色線性相關［8］，且某些條件下得到的反應產(chǎn)物抗氧活性優(yōu)于天然植物及提取物［9－10］．因此對Maillard 反應所產(chǎn)生的顏色物質進行研究具有十分重要的意義．

據(jù)文獻可知顏色物質產(chǎn)生于Maillard 反應的末期，由許多Maillard 反應高級階段形成的活性中間體進一步反應而得到［7］．通常認為294 nm 下吸光值的變化反映了Maillard 反應體系生成無色中間產(chǎn)物的量的變化［11］，此無色中間產(chǎn)物被認為是Maillard 反應或者焦糖化反應中褐色素形成的前體物質［12］．顏色物質的產(chǎn)生常通過測定體系在特定波長下的吸光值來研究，通常認為420 nm 下的吸光值可反映體系顏色物質的產(chǎn)生，也可稱其為褐變程度［12－14］． 目前關于還原糖與氨基酸體系中間產(chǎn)物及褐變程度的研究已較為完善［14－15］，但作為Maillard 反應研究的又一研究方向，針對抗壞血酸與氨基酸體系Maillard 反應褐變程度的研究還較少．為找出抗壞血酸/氨基酸體系褐變的變化規(guī)律，本實驗擬制備三種不同質量分數(shù)的反應液，比較其在294 nm 和420 nm 下的吸光值并與反應物的消耗聯(lián)系起來．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

P160001 厚壁耐壓反應瓶:北京欣維爾玻璃儀器有限公司．

L－抗壞血酸(分析純)，L－谷氨酸(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，偏磷酸(分析純)，磷酸氫二鈉(分析純)，磷酸二氫鈉(分析純)，乙腈(分析純)，乙腈(色譜純)，碳酸氫鈉(分析純)均為上海國藥集團化學試劑有限公司;2，4－二硝基氟苯(≥99%)，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;試驗用水皆為二次蒸餾水．

1．2 儀器與設備

UV2550 型紫外－可見光分光光度計(日本島津公司);10 mm 比色皿(日本島津公司);精密電子天平(瑞士Startorius 公司);PB－21 型實驗室pH 計(瑞士Startorius 公司);DF－101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司);HPLC1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)．

1．3 方法

1．3．1 緩沖溶液的制備 稱取3．12 g 二水合磷酸二氫鈉于100 mL 容量瓶中并用二次蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻;稱取71．6 g 十二水合磷酸氫二鈉于1 000 mL 容量瓶中并用二次蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻，配制成0．2 mol/L 的磷酸鹽溶液備用．分別取53 mL 磷酸二氫鈉溶液和947 mL 磷酸氫二鈉溶液于1 000 mL 容量瓶中混合均勻，配制成0．2 mol/L pH8．0 的磷酸緩沖溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)［16－19］．

1．3．2 樣品制備 氨基酸過量反應液的制備:樣品的制備參考文獻［16－18］的方法． 稱取0．880 7 g(5 mmol)抗壞血酸和8．827 8 g(60 mmol)谷氨酸溶于250 mL 磷酸緩沖溶液，適當加熱攪拌并用固體NaOH 將溶液pH 值調至8．00(25℃)，使其完全溶解．取15 mL 溶液密封于P160001 厚壁耐壓反應瓶中，在130℃的油浴中攪拌加熱，反應30、60、90、120、150 min，冷水快速冷卻至室溫，冰箱冷藏，每個實驗點均反應三份作為平行樣．

抗壞血酸過量反應液的制備:稱取10．567 8 g(60 mmol)抗壞血酸和0．735 7 g(5 mmol)谷氨酸溶于250 mL 磷酸緩沖溶液，適當加熱攪拌并用固體NaOH 將溶液pH 值調至8．00(25℃)，使其完全溶解．取15 mL 溶液密封于P160001 厚壁耐壓反應瓶中，與氨基酸過量溶液在相同條件下反應，每個實驗點均反應三份作為平行樣．

反應物等摩爾反應液的制備:稱取0．880 65(5 mmol)抗壞血酸和0．735 7(5 mmol)谷氨酸溶于250 mL 磷酸緩沖溶液，適當加熱攪拌并用固體NaOH 將溶液pH 值調至8．00(25℃)，使其完全溶解．取15 mL 溶液密封于P160001 厚壁耐壓反應瓶中，與上述兩種溶液在相同條件下反應，每個實驗點均反應三份作為平行樣．

1．3．3 抗壞血酸質量分數(shù)的測定 標準曲線的繪制:準確稱取25．0 mg 抗壞血酸并小心移至250 mL 棕色容量瓶中，用3%的偏磷酸溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成0．1 mg/mL 母液備用(現(xiàn)配現(xiàn)用)．分別取0．2，0．4，0.6，0．8，1．0，1．4，1．8，2．2，2．6，3．0，4．0，5．0 mL 母液，用3%偏磷酸溶液稀釋至10 mL，混合均勻．對溶液進行進行全波長掃描，找到最大吸收波長，在此波長下以3%偏磷酸做參比，得到抗壞血酸質量分數(shù)與吸光值的關系，并繪制標準曲線．

樣品的測定:取100 μL 反應液小心移入25 mL 棕色容量瓶中用3%偏磷酸稀釋至刻度，測其吸光值，并換算成樣品中抗壞血酸的質量分數(shù)［18］．

1．3．4 谷氨酸質量分數(shù)的測定 色譜條件:安捷倫C18 色譜柱;二極管陣列檢測器;流動相:由A，B，C 三組分組成，A 為水，B 為乙腈，C 為0．01 mol/L 磷酸緩沖溶液;流速為1．0 mL/min;柱溫30℃;進樣量10 μL;梯度洗脫見表1．

標準曲線的測定:取0．25 g 谷氨酸用100 mL pH8 的磷酸緩沖溶液溶解，用磷酸緩沖溶液稀釋將其為0，0.2，0．4，0．6，0．8，1．0，1.5，2．0，2．5 mg/mL 的谷氨酸標準溶液．依次取1 mL 谷氨酸標準溶液、1 mL0．5 mol/L 碳酸氫鈉溶液、1 mL 1% 2，4－二硝基氟苯的乙腈溶液移入10 mL 棕色容量瓶并于60℃下反應60 min．反應結束后用磷酸緩沖溶液稀釋至刻度并進樣測定，得到谷氨酸衍生物的峰面積［19］．

表1 梯度洗脫表Tab．1 Gradient elution program

樣品測定:取1 mL 反應液按標準曲線測定中的方法進行衍生和檢測，得到峰面積并換算成樣品中谷氨酸的含量．

1．3．5 樣品褐變程度的測定 如前文所述，褐變程度的變化常用波長420 nm 下吸光值的變化來表示［10－12］．根據(jù)反應液的不同，將反應液稀釋0～25 倍不等，以二次蒸餾水做參比，采用UV2550 紫外－可見光分光光度計在λ420 nm 處測定吸光值，并換算成原反應液的吸光值．

1．3．6 樣品中間產(chǎn)物的測定 如前文所述，常認為λ294 nm 下吸光值的變化反映了體系Maillard 反應生成無色中間產(chǎn)物的量的變化，此無色中間產(chǎn)物可能是美拉德反應或者焦糖化反應中褐色素形成的前體物質［11－12］．依據(jù)參考文獻［19］的測定方法，根據(jù)反應液的不同，將反應液用3%的偏磷酸稀稀釋25～250 倍不等，以3%的偏磷酸做參比溶液，在λ294 nm 處測定其吸光值，并換算成原反應液的吸光值．

2 結果與分析

2．1 抗壞血酸與氨基酸的消耗

由圖1 可知反應體系中谷氨酸初始質量分數(shù)一致，在抗壞血酸過量情況下Maillard 反應液中谷氨酸剩余質量分數(shù)遠小于兩種反應物等摩爾的情況，即增大反應物的量有利于Maillard 反應的進行．但圖2 卻顯示抗壞血酸參與反應并不受氨基酸含量的影響，這表明，抗壞血酸并未像還原糖體系那樣直接與氨基酸發(fā)生羰氨縮合形成不穩(wěn)定的亞胺衍生物希夫堿．據(jù)文獻推測［8］，在試驗條件下抗壞血酸首先發(fā)生自身熱解，熱解產(chǎn)物含有醛基能與氨基酸發(fā)生羰氨縮合，本試驗證實了這一點，并推測抗壞血酸/氨基酸的Maillard 反應與還原糖/氨基酸體系相比在中間產(chǎn)物和褐變程度的生成上有較大區(qū)別．

圖1 抗壞血酸過量和等摩爾情況下剩余谷氨酸的質量分數(shù)Fig．1 The concentration of glutamic under excessive ascorbic acid or equimolar concentration

圖2 谷氨酸過量和等摩爾情況下剩余谷氨酸的質量分數(shù)Fig．2 The concentration of ascorbic acid under excessive glutamic or equimolar concentration

2．2 反應物對褐變程度的影響

顏色物質與反應液的許多理化性質有關，有研究表明Maillard 產(chǎn)物的抗氧化作用與其顏色線性相關［18］，一般認為反應液顏色越深，反應程度越深．對褐變程度的測定常選取420～490 nm 間某一固定波長，并測其吸光值，絕大多數(shù)文獻選取420 nm 作為褐變程度測定的波長［14－15］．為便于與其他文獻對Maillard 反應褐變的研究進行參考與對比，本試驗在420 nm 下測三種反應液的吸光值，結果見圖3．

圖3 顯示抗壞血酸過量時體系的吸光值顯著增加，褐變程度加深，褐色聚合物增長極快．由圖1 可知，抗壞血酸過量時，剩余氨基酸質量分數(shù)降低，體系反應速率加快，因此褐色聚合物的增長將加快，420 nm 處吸光值增大．而當谷氨酸過量時，同樣相當于增加反應物質量分數(shù)，體系反應速率也應相應增大，但圖3 中顯示谷氨酸過量時的褐變程度與等摩爾反應下基本一致，這可能是由于抗壞血酸的熱解是整個反應的速率控制步驟．據(jù)文獻［19－20］可知，還原糖/氨基酸體系中，任意增大某一反應物的量，另一反應物消耗增加，反應速率加快，褐色聚合物增長加快，體系顏色加深，這與抗壞血酸/氨基酸體系的褐變規(guī)律不一樣．

2．3 反應物對中間產(chǎn)物的影響

通常認為294 nm 下吸光值的變化反映了體系Maillard 反應生成無色中間產(chǎn)物的量的變化［9］，也有文獻認為此類物質為糖基化過程中產(chǎn)生的無色中間產(chǎn)物，如糖、醛和小分子酮等［10］．Ajandouz 等人認為該類物質可能是美拉德反應或者焦糖化反應中褐色素形成的前體物質［10］，因而研究294 nm 下吸光值的變化同樣對揭示體系顏色的變化十分重要．

由圖4 可知隨著Maillard 反應的進行，294 nm 下的吸光值逐漸升高．將三種反應液在此波長下的吸光值進行比較，結果顯示抗壞血酸過量時體系的吸光值顯著增加，中間產(chǎn)物含量增長極快．將圖4 與圖1 和圖3聯(lián)系可知，增加抗壞血酸含量，其熱解產(chǎn)物增多，谷氨酸消耗加快，體系反應速率顯著增加，生成更多中間產(chǎn)物并迅速聚合成棕色大分子類黑精等物質，使體系顏色加深．此外，294 nm 下吸光值的迅速升高還可能是因為這些中間產(chǎn)物主要是糖基化過程產(chǎn)生［10］，增加抗壞血酸含量，其熱解產(chǎn)物增多，醛類和小分子酮類含量增加．

圖3 三種不同反應液在420 nm 的吸光值Fig．3 The absorbance of three different solutions at 420 nm

圖4 三種不同反應液在294 nm 的吸光值Fig．4 The absorbance of three different solutions at 294 nm

與圖3 中420 nm 下吸光值情況不同的是，谷氨酸過量與反應物等摩爾情況下反應液在420 nm 的吸光值差別不大，但谷氨酸過量時反應液在294 nm 下的吸光值仍明顯高于等摩爾．這可能是因為除反應速率的影響外，不同反應物所提供的結構在形成新化合物時，對吸光值也有影響．由圖2 和圖3 可知，谷氨酸過量和等摩爾條件下，抗壞血酸熱解量變化不大，420 nm 下吸光值基本一致，據(jù)此猜測，420 nm 下吸光值受抗壞血酸影響．造成兩種不同波長下吸光值變化差異的原因可能是抗壞血酸與谷氨酸均能產(chǎn)生生色團，但在形成大分子類黑精的過程中，抗壞血酸產(chǎn)生的生色團在形成類黑精的過程中形成共軛體系，吸收波長移向長波方向，谷氨酸產(chǎn)生的生色團沒有參與形成類黑精而是轉變?yōu)樾》肿訐]發(fā)性物質或是在類黑精中沒有形成共軛體系．因此推測420 nm 下具有吸光值的結構是由抗壞血酸提供;而在294 nm 下具有吸光值的結構是由抗壞血酸與谷氨酸共同提供．

3 結論

在抗壞血酸/氨基酸液相體系中抗壞血酸通過自身熱解產(chǎn)生醛類等物質進行Maillard 反應，故與還原糖/氨基酸體系在中間產(chǎn)物的產(chǎn)生和褐變程度上有很大差異．

與傳統(tǒng)的還原糖/氨基酸體系相比，在抗壞血酸/氨基酸體系中增大氨基酸的含量并不能加深體系Maillard 反應的褐變程度，對無色中間產(chǎn)物的產(chǎn)生幫助也較為有限，而抗壞血酸對體系褐變程度的加深及中間產(chǎn)物的生成均起到十分明顯的促進作用，這對控制反應體系的顏色以滿足人們對食品色澤的要求具有十分重要的意義．

［1］ Martins S I F S，Jongen W M F，Boekel M A J S．A review of Maillard reaction in food and implications to kinetic modeling［J］．Trends in Food Science ＆ Technology，2000，11(9):364－373．

［2］ Limacher A，Kerler J，Davidek T，et al．Formation of furan and methylfuran by maillard－type reactions in model systems and food［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(10):3639－3647．

［3］ Martins S I F S，van Boekel M A J S．Melanoidins extinction coefficient in the glucose/glycine maillard reaction［J］．Food Chemistry，2003，83(1):135－142．

［4］ Giribet M C，Ribas A I．Kinetics of colour development in aqueous fructose systems at high temperatures［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80(14):2105－2113．

［5］ Nicolau L P，Revel G D，Bertrand A．Formation of flavor components by the reaction of amino acid and carbonyl compounds in mild conditions［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(9):3761－3766．

［6］ 蔡自建，王永，文勇立，等．種養(yǎng)結合循環(huán)利用模式下蔬菜的維生素C 含量及其抗氧化活性測定［J］． 西南民族大學學報:自然科學版，2013，39(1):5－7．

［7］ Morales F J，Jimenez－Perez S． Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence［J］． Food Chemistry，2001，72(1):119－125．

［8］ Hashiba H．The browning reaction of Amadori compounds derived from various sugars［J］．Agricultural Biological Chemistry，1982，46(2):547－548．

［9］ 楊赫鴻，劉騫，孔保華，等．美拉德反應中乳清分離蛋白特性的變化［J］．食品科學，2012，33(23):98－102．

［10］ Ajandouz E H，TchiakpeL S，Ore F D，et al．Effects of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics in fructose－lysine model systems［J］．Journal of Food Science，2001，66:926－931．

［11］ Murakami M，Shigeeda A，Danjo K，et al． Radical－scavenging activity and brightly colored pigments in the early stage of the maillard reaction［J］．Journal of Food Science，2002，67(1):93－96．

［12］ 李菁，劉騫，孔保華，等．L－賴氨酸與3 種還原糖美拉德反應產(chǎn)物的理化特性及抗氧化活性［J］．食品科學，2013，34(3):80－84．

［13］ 鄧啟輝．L－抗壞血酸/氨基酸模式體系中Maillard 反應產(chǎn)物的抗氧化活性研究［D］．恩施:湖北民族學院，2011．

［14］ 鐘存貴．抗壞血酸與谷胱甘肽的Maillard 反應形成香味化合物的研究［D］．恩施:湖北民族學院，2012．

［15］ 唐樂攀，周永妍，余愛農(nóng)．紫外分光光度法和高效液相色譜法測定Maillard 體系中抗壞血酸含量的比較［J］． 食品工業(yè)科技，2014，35(10):79－82．

［16］ 唐樂攀．抗壞血酸/半胱氨酸體系非酶褐變反應動力學研究［D］．恩施:湖北民族學院，2014．

［17］ 劉應煊．抗壞血酸與半胱氨酸的Maillard 反應形成香味化合物的研究［D］．武漢:中國地質大學，2010．

［18］ Anese M，Manzocco L，Nicoli M C，et al．Antioxidant properties of tomato juice as affected by heating［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79(5):750－754．

［19］ Baisier W M，Labuza P L．Maillard browning kinetics in a liquid model system［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40(5):707－713．

［20］ 楊春濤，曾曉麗，戴建輝，等．麻櫟樹皮多酚含量的測定及抗氧化活性的研究［J］．云南大學學報:自然科學版，2014，23(6):404－407．