肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

李冬梅

天津市河北區(qū)婦女兒童保健中心檢驗(yàn)科　300142

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肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

李冬梅

天津市河北區(qū)婦女兒童保健中心檢驗(yàn)科300142

摘要肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥，近幾年，我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)肺炎支原體的病因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在患者的呼吸道感染中，肺炎支原體的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)的肺炎支原體患者的發(fā)病率占患有肺炎的13%~20%，其發(fā)病率以兒童多見。本文首先肺炎支原體進(jìn)行概述，然后分析了肺炎支原體病變的特征，接著敘述了肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及診斷方法，最后根據(jù)其診斷方法進(jìn)行了研究。

關(guān)鍵詞肺炎支原體實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

目前，肺炎支原體是非典型肺炎的主要病因之一，是引起呼吸道感染的主要炎癥，兒童發(fā)病率較為常見。近幾年，成年人肺炎支原體的發(fā)病率也隨之增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，在肺炎支原體發(fā)病率中，成年人的感染率迅速增加。但是肺炎支原體與其他病原體感染的肺炎，差別不大，并且對(duì)治療肺炎和呼吸道感染的一般藥物具有一定的耐藥性。所以，實(shí)驗(yàn)室對(duì)肺炎支原體進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，對(duì)于治療肺炎支原體有著非常重要的意義。

1肺炎支原體概述

肺炎支原體是一種缺少細(xì)胞壁，而且在形態(tài)上具有多形性，并可以通過除菌濾器，在沒有生命的培養(yǎng)基中可以繁殖最小的原核細(xì)胞微生物，而無細(xì)胞壁只有細(xì)胞膜，呈革蘭染色陰性，形狀一般為細(xì)絲狀。支原體的黏膜作用以及免疫應(yīng)答影響著支原體的感染發(fā)病機(jī)制。支原體是通過滑行運(yùn)動(dòng)的方式到黏膜組織內(nèi)，通常隱藏在細(xì)胞間的隱窩內(nèi)，因?yàn)橹гw具有特殊的結(jié)構(gòu)，主要結(jié)構(gòu)有粘附因子，可以利用粘附因子粘附在細(xì)胞表面，它是一種蛋白，這種蛋白是一種免疫原，它可以促使體內(nèi)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，是對(duì)支原體進(jìn)行診斷的一種重要的抗原體。

肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥，通過呼吸道飛沫進(jìn)行傳播的，除了引起肺炎等呼吸道疾病之外，還可能會(huì)引起其他的并發(fā)癥，例如腦膜炎、脊髓炎、心包炎、腎炎以及腦干炎等[1]。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，肺炎支原體每3~5年流行1次，主要在不同群體中流行，發(fā)病特點(diǎn)表現(xiàn)為間接性，而且時(shí)間長(zhǎng)，播散緩慢，在地區(qū)中流行的時(shí)間可持續(xù)為幾個(gè)月甚至長(zhǎng)達(dá)1年，有時(shí)候還能造成爆發(fā)性流行。全年均有發(fā)病的現(xiàn)象，但在冬季發(fā)病相對(duì)率較高。

對(duì)肺炎支原體的臨床治療可選擇：(1)對(duì)微生物蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行干擾和抑制；(2)在核糖體30S中，阻止肽鏈的延伸與蛋白質(zhì)的合成，對(duì)DNA復(fù)制的四環(huán)抗生素進(jìn)行抑制；(3)在核酸DNA中，對(duì)其復(fù)制的喹諾酮類抗生素進(jìn)行抑制[2]。

2肺炎支原體的病變

肺炎支原體的病變主要在肺部出現(xiàn)，有漿液纖維素性胸膜炎變化，在胸腔中積液時(shí)會(huì)有纖維性滲出物出現(xiàn)，導(dǎo)致支氣管和縱隔淋巴結(jié)腫大、充血甚至出血。據(jù)有關(guān)報(bào)道，肺炎支原體還可以導(dǎo)致體內(nèi)器官功能不全，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)肺炎支原體的重視[3]。肺炎支原體的病變主要體現(xiàn)在心肌乏力或心包積液。其病程長(zhǎng)的患者肺部的病變尤為明顯，表現(xiàn)為組織增生，甚至還會(huì)出現(xiàn)包囊化的壞死灶。肺炎支原體組織的病變?cè)诓煌潭壬蠒?huì)呈現(xiàn)不同的變形性顆粒與不同的脂肪變性等，肺門淋巴結(jié)甚至?xí)霈F(xiàn)反應(yīng)性的增生；皮組織有萎縮現(xiàn)象，出現(xiàn)纖維素性肺炎支原體和淋巴細(xì)胞性肺炎支原體等，這些典型的病例會(huì)呈現(xiàn)多方面的變化。

3對(duì)肺炎支原體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1分離培養(yǎng)目前世界衛(wèi)生組織推薦的對(duì)支原體感染診斷的標(biāo)準(zhǔn)方式就是培養(yǎng)肺炎支原體的分離方式。支原體的基因很小，新陳代謝能力緩慢，所以繁殖相對(duì)來講較為緩慢，每2~6h繁殖1次；其繁殖離不開葡萄糖和膽固醇；經(jīng)過重復(fù)繁殖，繁殖后形狀類似“荷包蛋”，顯示為陽(yáng)性。對(duì)肺炎支原體分離采用的一般的培養(yǎng)方式，是利用痰、肺泡沖洗液、咽拭子以及胸腔積液，在培養(yǎng)基上對(duì)肺炎支原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，但因?yàn)橹гw沒有合成的能力，培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)發(fā)揮其作用進(jìn)行添加促進(jìn)其合成的物質(zhì)，例如脂肪醇等物質(zhì)。但是這種方式的不足點(diǎn)是靈敏度不高，而且培養(yǎng)的時(shí)間比較長(zhǎng)，一般在20d左右，技術(shù)的要求性比較高，不能達(dá)到快速診斷的目的，所以在臨床中采用這種方式較少[4]。

3.2直接檢測(cè)直接檢測(cè)采用的方式一般為免疫熒光方法，先取患者呼吸道分泌物，再采用鼠抗人單克隆抗體，以及異硫氰酸熒光素對(duì)羊抗鼠標(biāo)記的抗體對(duì)支原體進(jìn)行檢測(cè)，通過利用顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)被標(biāo)記的支原體有沒有被感染[5]。采用這種方式方便快捷，但不足點(diǎn)是在臨床中還沒有找到和合適的視野，或者是未能取到感染細(xì)胞而導(dǎo)致被檢測(cè)忽略而導(dǎo)致被檢測(cè)忽略而漏檢，因而造成判斷不準(zhǔn)確。另外，在檢測(cè)中，細(xì)胞內(nèi)的其他病原體可能會(huì)進(jìn)行干擾，也會(huì)造成判斷不準(zhǔn)確。所以這種方式因各種因素容易受到干擾，不能準(zhǔn)確的進(jìn)行判斷，而影響最終的判斷結(jié)果。

3.3基因檢測(cè)基因檢測(cè)可采用培養(yǎng)增強(qiáng)套式PCR法，這是PCR結(jié)合支原體檢測(cè)的方法，選取肺炎支原體患者一定量的痰液以及咽拭子，在支原體專用液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，1d后取出這些培養(yǎng)液在進(jìn)行下一步的培養(yǎng)，并進(jìn)行兩次擴(kuò)增，兩次培養(yǎng)中的反應(yīng)條件是一樣的，利用紫外檢測(cè)儀對(duì)第2次培養(yǎng)中擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行觀察其結(jié)果，因?yàn)樗信c陽(yáng)性一樣的條帶，所以判斷為陽(yáng)性。通過實(shí)驗(yàn)采用以上兩種方法同本方法進(jìn)行對(duì)照，陽(yáng)性率分別為26.4%，26.8%和27.4%，由此可見，PCR方式不僅靈敏度準(zhǔn)確，而且陽(yáng)性率也高，但不足點(diǎn)是操作比較復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)。有條件的實(shí)驗(yàn)室可以采用這種方法對(duì)支原體進(jìn)行檢測(cè)。采用這種方式的不足點(diǎn)是，由于培養(yǎng)增強(qiáng)套式PCR的方法由于具有敏感的特點(diǎn)，在對(duì)支原體進(jìn)行的過程中可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或者是假陰性的現(xiàn)象，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的因素主要體現(xiàn)在：作為檢測(cè)的標(biāo)本已經(jīng)被污染；由于細(xì)菌的種類繁多，難免會(huì)出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，還有就是基因的相似性，這種基因看起來很像似，但它們是不同種類，這樣對(duì)判斷會(huì)造成影響，容易誤判為陽(yáng)性的結(jié)果；在實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本中存在種類繁多的蛋白，有的蛋白會(huì)阻止PCR的擴(kuò)增，而導(dǎo)致漏撿的現(xiàn)象發(fā)生[6]。

3.4藥敏檢測(cè)藥物檢測(cè)可采用抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，目前關(guān)于對(duì)藥敏分析的報(bào)道相對(duì)較少，因?yàn)橹гw傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)起來比較復(fù)雜，而且耗用的時(shí)間也長(zhǎng)，對(duì)其要求相對(duì)較高[7]。近幾年，我國(guó)有臨床試驗(yàn)研發(fā)了支原體的快速培養(yǎng)同藥敏結(jié)合的一種藥敏試劑盒，1~2d內(nèi)就可以出結(jié)果。這種藥敏試劑盒在對(duì)支原體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，起了一定的作用，對(duì)于檢測(cè)支原體常用到的藥物，其中具有四類抗生素分別為：喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林克酰胺類以及四環(huán)素類，它都可以提供，而且采用這種方法進(jìn)行檢測(cè)的要求不高，不需要高端和復(fù)雜的儀器設(shè)備。通過對(duì)60例肺炎支原體患者的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感率中，阿奇霉素占44.3%，紅霉素占34.6%，耐藥率較高。據(jù)北京的一家醫(yī)院報(bào)道，70例肺炎支原體患者，其中大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率達(dá)到了70%，這需要實(shí)驗(yàn)室對(duì)支原體藥敏進(jìn)行多次檢測(cè)[8]。支原體藥敏的檢測(cè)可以指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，減少肺炎支原體的發(fā)生，同時(shí)還可以使耐藥株的產(chǎn)生有效減少。

4肺炎支原體的診斷方法

4.1病原學(xué)診斷病原學(xué)診斷是一種分離性培養(yǎng)，是對(duì)支原體感染進(jìn)行診斷的一種經(jīng)典方法，也是至今最為可靠的方法。在同一種培養(yǎng)基中，支原體的成長(zhǎng)過程與培養(yǎng)基中血清的種類密切相關(guān)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)表明，加入豬血清到培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)過程最好，馬血清僅次于豬血清，最后是牛血清。在培養(yǎng)基中加入15%的馬血清，進(jìn)行4~5d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基由原來的紅色逐漸變?yōu)辄S色，而且菌液清澈有光澤、沒有菌膜現(xiàn)象，也沒有渾濁現(xiàn)象。

染色檢查是以菌種培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，革蘭陰性，但其不足點(diǎn)是著色不佳，常吉母薩氏法染色。經(jīng)過甲醇進(jìn)行5min的固定之后，用常吉母薩氏法染色過夜，油鏡鏡檢為：支原體菌體的顏色呈現(xiàn)為藍(lán)紫色，形狀為細(xì)小的弧狀、桿狀、球狀和絲狀以及和等典型的多中形狀。

結(jié)合小兒肺炎支原體，試驗(yàn)應(yīng)用肺炎支原體被動(dòng)凝集法和快速培養(yǎng)法，針對(duì)小兒支原體肺炎在不同病程中的應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)試驗(yàn)表明，被動(dòng)凝集法和快速培養(yǎng)法的靈敏度分別為50.03%與83.33%，特異度分別為100%與94%，以及陽(yáng)性率分別為23.3%與42.3%(P<0.05)，科學(xué)合理地對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行慎重選擇，在對(duì)小兒肺炎支原體的臨床診斷中，肺炎支原體被動(dòng)凝集法與快速培養(yǎng)法具有非常重要的意義[9]。

4.2生物學(xué)診斷在肺炎支原體感染中的應(yīng)用中，通過對(duì)比肺炎支原體抗體檢測(cè)法和熒光定量檢測(cè)法，將兩種檢測(cè)的方法進(jìn)行結(jié)合，具有互補(bǔ)作用，可以相互間取長(zhǎng)補(bǔ)短，這樣可以使肺炎支原體感染的初檢率得以提高。采用熒光定量檢測(cè)法與血清學(xué)檢測(cè)法對(duì)肺炎支原體咽拭子和血清標(biāo)本經(jīng)肺炎支原體核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，采用與血清學(xué)檢測(cè)法對(duì)肺炎支原體檢測(cè)中，其敏感性與特異性均高于血清學(xué)檢測(cè)法，由此可見，熒光定量檢測(cè)法對(duì)該病狀的診斷和治療具有重要的意義。

4.3免疫學(xué)診斷目前來看，血清學(xué)的診斷技術(shù)在臨床中的應(yīng)用相對(duì)較多，主要有間接血凝實(shí)驗(yàn)、顆粒凝集法、酶聯(lián)免疫吸附法、螢火抗體實(shí)驗(yàn)、直接補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和代謝抑制試驗(yàn)等方法。

試驗(yàn)將酶聯(lián)免疫吸附法和顆粒凝集法對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)兩種方法的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，經(jīng)分析，顆粒凝集法對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度與特異性均為97%，用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度和特異性均為88%，由此可見，顆粒凝集法的敏感度與特異性均相同，說明重復(fù)性好，但不足點(diǎn)是操作比較復(fù)雜。

經(jīng)以上分析，通過酶聯(lián)免疫吸附法和顆粒凝集法對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者的陽(yáng)性檢出率具有一定的差異性，酶聯(lián)免疫吸附法的陽(yáng)性率呈現(xiàn)最高，為62%顆粒凝集法的陽(yáng)性率為56%。酶聯(lián)免疫吸附法可同時(shí)定量檢測(cè)可進(jìn)一步提高診斷率。

4.4聯(lián)合性診斷用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，肺炎支原體的DNA采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)方法的效果進(jìn)行分析。

采取酶聯(lián)免疫法對(duì)患者進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)室同時(shí)做相應(yīng)的檢測(cè)輔助診斷，并提出“肺炎支原體感染臨床診斷要結(jié)合冷凝集試驗(yàn)、痰及細(xì)菌培養(yǎng)、血細(xì)胞分析以及血尿常規(guī)檢查等多項(xiàng)檢查進(jìn)行輔助確診，避免出現(xiàn)漏診現(xiàn)象”的結(jié)論。

對(duì)患者血清中的抗體采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)感染肺炎支原體的患者進(jìn)行相應(yīng)的冷凝集試驗(yàn)、痰及細(xì)菌培養(yǎng)、血細(xì)胞分析以及血尿常規(guī)檢查等進(jìn)行檢查[10]。為了對(duì)患者方便診斷與治療，需要對(duì)患者肺炎支原體感染進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)，另外，對(duì)于難治的肺炎支原體，做出了詳細(xì)的臨床研究，并對(duì)其做出了較為詳細(xì)的講解。

隨著人們對(duì)肺炎支原體的認(rèn)識(shí)以及實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)方法也在不斷更新。肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法有很多種，都有著一定的優(yōu)勢(shì)與不足。目前我國(guó)對(duì)肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)還沒有制定統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以臨床可以根據(jù)情況選擇不同的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合本文中給出的不同方法對(duì)肺炎支原體的檢測(cè)，要利用其互補(bǔ)作用，需要相互補(bǔ)充，為臨床的早期診斷和早期治療提供有效的依據(jù)。

以上所述，對(duì)肺炎支原體的診斷方法有很多，對(duì)患者進(jìn)行早期診斷與治療，可有效縮短其病程。另外，采用聯(lián)合診斷，還可以使檢測(cè)敏感度與早期診斷率明顯提高。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要采用病原學(xué)診斷、生物學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷以及聯(lián)合性診斷方法。隨著科學(xué)與醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，肺炎支原體的診斷理念逐漸由原來的二級(jí)預(yù)防轉(zhuǎn)為一級(jí)預(yù)防，可以更好地為患者服務(wù)，使患者的健康質(zhì)量進(jìn)一步得到保障。

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(編輯楊陽(yáng))

收稿日期2015-04-24

中圖分類號(hào)：R563.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)17-2305-03