微孔板和分光光度計(jì)法檢測(cè)7種食用菌的抗氧化活性

李根林， 李 竹， 吳宿慧， 李寒冰， 張顏語， 呂 寧， 韓素月， 王晨琳， 楊 陽

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008）

微孔板和分光光度計(jì)法檢測(cè)7種食用菌的抗氧化活性

李根林， 李 竹， 吳宿慧*， 李寒冰， 張顏語， 呂 寧， 韓素月， 王晨琳， 楊 陽

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008）

目的 建立微量檢測(cè)食用菌體外清除二苯代苦味酰基自由基 （DPPH·）活性的方法，并比較常見食用菌的抗氧化活性，為尋找天然抗氧化劑提供初步的篩選方法和技術(shù)資料。方法 超聲提取得到香菇等7種食用菌和火麻仁的提取物后，采用微孔板與分光光度計(jì)法測(cè)定其DPPH·清除率，然后對(duì)這兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行曲線擬合，并對(duì)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、試劑用量和方法重復(fù)性方面進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而比較其DPPH·清除活性。結(jié)果 兩種方法所得的DPPH·清除率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、試劑用量等方面，微孔板法有明顯優(yōu)勢(shì)。另外，食用菌水提物的抗氧化活性均明顯高于醇提物，其中香菇水提物的活性最高。結(jié)論 微孔板法測(cè)定食用菌DPPH·的清除活性時(shí)具有準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)，而且食用菇水溶性成分的抗氧化活性大于醇溶性成分，可為后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)資料。

食用菌；抗氧化活性；微孔板；分光光度計(jì)；DPPH·

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，當(dāng)體內(nèi)代謝產(chǎn)物的自由基過多或清除能力下降時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生物細(xì)胞氧化性損傷，引發(fā)心血管疾病、癌癥等各種病變［1］，因此清除體內(nèi)外過量自由基有著重要意義，而多種食用菌具有確切的體外抗氧化活性［2］。目前，分光光度計(jì)法［3］作為一種經(jīng)典的抗氧化實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于藥品和食品的檢測(cè)，其簡(jiǎn)便易行［4-7］，但測(cè)試大規(guī)模樣品時(shí)存在耗時(shí)長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗大等缺陷，因此建立一種快速、精確、低成本的抗氧化活性測(cè)定方法具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分光光度計(jì)法進(jìn)行改良，并以陽性對(duì)照品維生素E（VE）、具有DPPH·清除作用的火麻仁及香菇為研究對(duì)象，建立微孔板法對(duì)香菇等7種食用菌進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定，期冀為其活性初篩和相關(guān)機(jī)能食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 樣品購自河南省鄭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定，分別為真菌類擔(dān)子菌綱傘菌目傘菌科香蕈Lentinus edodes（Berk.）Sing的子實(shí)體香菇、擔(dān)子剛傘菌目側(cè)耳科真菌糙皮側(cè)耳Pleurotus ostreatus（Jacq.ex Fr.）Quel的子實(shí)體平菇、層菌綱傘菌目側(cè)耳科真菌刺芹側(cè)耳Pleurotus eryngii的子實(shí)體杏鮑菇、傘菌目白蘑科真菌冬菇Flammulina velutiper（Fr.）Sing的子實(shí)體金針菇、層菌綱傘菌目白蘑科真菌真姬菇Hypsizygusmarmoreus（Peck）H.E.Bigelow不同品種的子實(shí)體白玉菇、蟹味菇、海鮮菇。

火麻仁購自鄭州本草國藥館，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定，為桑科植物大麻Cannabissativa L的干燥成熟果實(shí)。

二苯代苦味?；杂苫―PPH·，批號(hào)STBC5116V，美國Sigma公司）；天然型維生素E膠丸 （批號(hào)20131008，青島雙鯨藥業(yè)有限公司）。無水乙醇為分析純 （批號(hào)20130630，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器設(shè)備 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）；分析天平 （德國賽多利斯公司）；100～200目藥材粉碎機(jī) （北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；Dragon移液器（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）；VIS-7220N可見分光光度計(jì)（北京瑞麗分析儀器有限公司）；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KQ-250DE數(shù)控

超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D循環(huán)真空泵 （鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 取食用菌適量，去除表面殘留的培養(yǎng)基等雜質(zhì)，洗凈，60℃下干燥，粉碎，過60目篩，密封備用。另取火麻仁適量，去皮搗碎，過60目篩，密封備用。

1.3.2 DPPH·溶液的制備［8-9］精密稱取DPPH·0.020 1 g，置于250 mL量瓶中，無水乙醇定容至250 mL，搖勻，即得0.2 mmol/L DPPH·溶液，4℃下避光保存，備用。

1.3.3 陽性對(duì)照品維生素E（VE）溶液的制備［8-9］取維生素E膠丸4粒 （每粒含VE 100 mg），剪破膠丸殼，加入無水乙醇5 mL溶解，搖勻，即得80 mg/mL VE溶液。

1.3.4 樣品制備 稱取食用菌干粉 （30.000±0.001）g兩份，分別加入20倍量雙蒸水和無水乙醇，超聲提取25 min（25℃、20 kHz），抽濾，提取液濃縮至1 000 mg/mL，4℃下保存?zhèn)溆??；鹇槿蕵悠返闹苽浞椒ㄅc食用菌相同。

1.3.5 微孔板法 以VE、食用菌香菇水提物、火麻仁醇提物為受試品，每份設(shè)置3組，即對(duì)照組、樣品組、空白組（消除樣品背景色），分別加樣于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。其中，樣品組加入0.5倍梯度稀釋的不同濃度受試品溶液100μL和DPPH·溶液100μL，每孔反應(yīng)體系200μL；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH·溶液；對(duì)照組以等體積蒸餾水或無水乙醇代替受試品溶液，加樣方法及加樣量見表1。加樣結(jié)束后，室溫下避光反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度3次，取平均值，計(jì)算DPPH·的清除率。

表1 各組加樣方法與加樣量

1.3.6 分光光度計(jì)法［8-10］反應(yīng)于10 mL離心管中進(jìn)行，各試劑加樣方法同 “1.3.5”項(xiàng)，但加樣量均為3 mL，每管反應(yīng)體系均為6 mL，室溫下避光反應(yīng)30 m in，然后可見分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度3次，取平均值，計(jì)算DPPH·的清除率。

1.3.7 測(cè)定方法擬合 對(duì) “1.3.5”和 “1.3.6”項(xiàng)下兩種方法所得的結(jié)果進(jìn)行曲線擬合，并進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以比較兩者的RSD。

1.3.8 微孔板法測(cè)定食用菇的抗氧化活性 按 “1.3.5”項(xiàng)下方法，對(duì)7種食用菌提取物的DPPH·清除率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 計(jì)算方法 計(jì)算公式為DPPH·清除率=［Ac-（A-Aj）］/Ac×100%，Reed Muench法計(jì)算IC50，SPSS 19.0軟件進(jìn)行曲線擬合，Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）。

2 結(jié)果

2.1 曲線擬合模型的建立 維生素E作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別以微孔板和分光光度計(jì)法所得清除率為因變量，受試品溶液濃度為自變量，建立曲線擬合模型，SPSS 19.0軟件進(jìn)行擬合，并加以比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義優(yōu)于其他模型，因此對(duì)對(duì)數(shù)模型參數(shù)進(jìn)行描述。

在微孔板法的對(duì)數(shù)模型單因素方差分析（one-way ANOVA）中，F(xiàn)（1，4）=71.402，P＜0.001，對(duì)模型中系數(shù)和常數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，系數(shù)23.300的t= 8.450，P＜0.001，而常數(shù)22.441的t=4.702，P＜0.01，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于實(shí)驗(yàn)分析。另外，模型的決定系數(shù)R=0.973，公式為y=23.3Ln（x）+22.441。

在分光光度計(jì)法的對(duì)數(shù)模型one-way ANOVA中，F(xiàn)（1，4）=79.981，P＜0.001，對(duì)模型中系數(shù)和常數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，系數(shù)23.895的t=8.943，P＜0.001，而常數(shù)20.768的t=4.491，P＜0.05，表明該模型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可用于實(shí)驗(yàn)分析。另外，模型的決定系數(shù)R=0.976，公式為y=23.895Ln（x）+20.768，見圖1和表2。

圖1 維生素E水提物微孔板法與分光光度計(jì)法的擬合曲線

表2 維生素E曲線擬合的方法學(xué)考察

為了驗(yàn)證模型的可行性，本實(shí)驗(yàn)選擇抗氧化活性已知的火麻仁油 （標(biāo)準(zhǔn)受試品）及未知的香菇進(jìn)行曲線擬合。結(jié)果表明，火麻仁醇提物微孔板法的模型公式為y= 22.425Ln（x）-43.828，分光光度計(jì)法的模型公式為y= 22.245Ln（x）-43.167；香菇水提物微孔板法的模型公式為y=19.182Ln（x）+31.168，分光光度計(jì)法的模型公式為y=20.139Ln（x）+30.049，而且均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、圖3、表3。

2.2 微孔板和分光光度計(jì)法的差異比較 微孔板和分光光度計(jì)法所得的3種受試品的DPPH·清除率量效關(guān)系擬合曲線的相似度較高，重疊率也很高，見圖1～圖3，可認(rèn)為

兩種方法的結(jié)果一致。另外，還對(duì)這兩種方法在實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、試劑用量和重復(fù)性方面進(jìn)行比較，見表4，可知兩種測(cè)定方法所得的IC50值相當(dāng)；在實(shí)驗(yàn)耗時(shí)方面，微孔板法約40～45 min，而分光光度計(jì)法約55～60 min，但由于前者的反應(yīng)體系在96孔板中進(jìn)行，理論上可以一次測(cè)定96個(gè)樣品，而后者一次只能測(cè)定一個(gè)樣品，因此在大規(guī)模樣品篩選時(shí)，微孔板法的測(cè)定效率將顯著提高；在試劑用量方面，微孔板法只有分光光度計(jì)法的3.33%左右；在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，各組樣品間RSD值差異不大，說明這兩種方法在多次測(cè)定同一樣品時(shí)的結(jié)果變異小，重復(fù)性好。

圖2 香菇水提物微孔板法與分光光度計(jì)法的擬合曲線

圖3 火麻仁醇提物微孔板法與分光光度計(jì)法的擬合曲線

表3 曲線擬合的方法學(xué)考察

2.3 微孔板法測(cè)定7種食用菌水提物的體外抗氧化活性（圖4） 由圖可知，其半對(duì)數(shù)量效關(guān)系曲線均呈明顯的“S”型，與陽性對(duì)照藥VE的趨勢(shì)相同。由此說明，它們均具有體外清除DPPH·的能力，而且香菇水提物的抗氧化活性明顯高于其他食用菌。

表4 3種受試品微孔板與分光光度計(jì)法的相關(guān)指標(biāo)對(duì)比（n=8）

圖4 7種食用菌水提物抗氧化活性對(duì)比

2.4 微孔板法測(cè)定7種食用菌醇提物的體外抗氧化活性（圖5） 由圖可知，其半對(duì)數(shù)量效關(guān)系曲線也均呈明顯的“S”型，與陽性對(duì)照藥VE的趨勢(shì)也相同。由此說明，醇提物也有一定的抗氧化活性。

圖5 7種食用菌醇提物體外抗氧化活性對(duì)比

2.5 7種食用菌水提物和醇提物的體外抗氧化活性比較（表5） 由表可知，食用菌水提物的抗氧化活性依次為香菇＞平菇＞白玉菇＞杏鮑菇＞海鮮菇＞金針菇＞蟹味菇，而醇提物依次為白玉菇＞平菇＞香菇＞海鮮菇＞杏鮑菇＞金針菇＞蟹味菇。由此說明，香菇水提液 （2.81 mg/mL）的抗氧化活性最高，而且7種食用菌水提物的IC50值均明顯低于醇提物，說明前者的體外抗氧化活性大于后者。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)分光光度計(jì)法測(cè)定體外抗氧化活性的基礎(chǔ)上，建立了微孔板法篩選模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法與分光光度計(jì)法相比，具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)試速度快、耗費(fèi)試劑少、精確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，并克服了傳統(tǒng)方法操作費(fèi)時(shí)、溶劑量大、成本高等不足，與文獻(xiàn) ［11］報(bào)道一致。因此，微孔板法適合大規(guī)模樣品初篩，具有良好的實(shí)用性，尤其是對(duì)微量天然產(chǎn)物 （如食用菌等）抗氧化活性的測(cè)試。

表5 7種食用菌水提物和醇提物DPPH·清除率的IC50值（mg/m L）

另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，7種食用菌水提物與醇提物的抗氧化活性有明顯差異，水提物的抗氧化活性明顯大于醇提物，并且香菇水提物的活性最高，這為尋找天然抗氧化劑提供了參考，也為香菇等食用菌的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了技術(shù)依據(jù)。

［1］ 李根林，馬永潔，孫靜雅，等.火麻仁甾醇對(duì)DPPH·及亞硝酸鹽自由基清除作用的研究［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28（5）：693-695.

［2］ 唐 鵬，李學(xué)英，王大忠.食用菌多糖藥理作用研究進(jìn)展［J］.臨床合理用藥，2014，7（6）：176-178.

［3］ 張 儒，張變玲，趙 勇，等.人參根中黃酮類化合物提取及其抗氧化性研究［J］.中成藥，2012，34（10）：1896-1900.

［4］ 彭長(zhǎng)連，陳少薇.用清除有機(jī)自由基DPPH機(jī)法評(píng)價(jià)植物抗氧化能力［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（6）：658-661.

［5］ Chandrasekar D，Madhusudhana K，Ramakrishna S，etal.Determination of DPPH free radical scavenging activity by reversedphase HPLC：a sensitive screeningmethod for polyherbal formulations［J］.JPharm Biomed Anal，2006，40（2）：460-464.

［6］ 勾明玥，劉 梁，張春枝.采用DPPH法測(cè)定26種植物的抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）：148-150.

［7］ Sharma O，Bhat T N.DPPH antioxidant assay revisited［J］. Food Chem，2008，113（4）：1202-1205.

［8］ 李寒冰，齊向云，李根林，等.基于抗氧化活性測(cè)定的山藥品質(zhì)評(píng)價(jià)新方法［J］.中成藥，2012，34（7）：1370-1373.

［9］ 吳宿慧，馬永潔，蔣 娜，等.決明子抗衰老系列實(shí)驗(yàn)I：決明子體外抗氧化與抑制胰脂肪酶活性研究［J］.中國醫(yī)藥指南，2013，11（34）：342-344.

［10］ Fu H Y，Shieh D E，Ho CT.Antioxidantand free radicalscavenging activities of ediblemushrooms［J］.JFood Lipids，2002，9（1）：35-43.

［11］ 王 麗，張 麗，康文藝，等.蘆丁清除DPPH自由基分光光度法與微量法抗氧化活性研究［J］.中成藥，2009，31（11）：1785-1787.

R284.1

B

1001-1528（2015）12-2772-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.046

2014-12-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81473435）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目 （2013GGJS-092）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)資助項(xiàng)目 （14A310023）；河南中醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目 （2014YCX009）；河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)項(xiàng)目 （YXCX［2014］22）

李根林 （1963—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥生物活性評(píng)價(jià)研究。Tel：13703920231，E-mail：lhb9988@163.com

*通信作者：吳宿慧 （1980—），女，講師，從事中藥藥理學(xué)研究。Tel：（0371）65962746，E-mail：iwusuhui@163.com