核轉(zhuǎn)錄因子和明膠酶在鼻息肉中的表達(dá)及臨床意義

孫樹軍，趙立民，殷憲寶

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山東 濰坊 261030；2.山東省棗莊市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，山東 棗莊 277000）

·臨床論著·

核轉(zhuǎn)錄因子和明膠酶在鼻息肉中的表達(dá)及臨床意義

孫樹軍1，趙立民1，殷憲寶2

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山東 濰坊 261030；2.山東省棗莊市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，山東 棗莊 277000）

目的觀察核轉(zhuǎn)錄因子（p-STAT3）及明膠酶（MMPs）在鼻息肉組織中的表達(dá)情況，探討兩者在鼻息肉發(fā)病過(guò)程中的作用及相互關(guān)系，為鼻息肉的臨床治療提供幫助和新的思路。方法收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科2008年5月-2013年4月期間行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者45例（鼻息肉組35例，下鼻甲黏膜組10例），采用常規(guī)病理和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉及下鼻甲組織中的表達(dá)情況。結(jié)果MMP-2、9在鼻息肉組和下鼻甲黏膜組的表達(dá)分別為68.6%（24/35）、20%（2/10)；82.9%（29/35）、20%（2/10），鼻息肉組與下鼻甲黏膜組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p-STAT3在鼻息肉及下鼻甲黏膜組的陽(yáng)性表達(dá)率為71.4%（25/35）、0.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。P-STAT3和MMP-2、9存在著正相關(guān)關(guān)系（r =0.278，r=0.312，P＜0.05）。結(jié)論p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉組織的高表達(dá)和正相關(guān)性說(shuō)明兩者在鼻息肉的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，可作為臨床治療鼻息肉病的檢測(cè)指標(biāo)之一。

STAT3；MMP-2、9；鼻息肉；免疫組織化學(xué)

鼻息肉是多種原因?qū)е碌谋乔患氨歉]慢性炎癥性疾病，鼻息肉的主要組織病理特征是上皮下水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而且伴隨上皮層的增生、纖維化和基底膜的增厚。這些特征性改變需要多種因素結(jié)合才能完成，Th淋巴細(xì)胞，尤其是Th17細(xì)胞在鼻息肉的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色，對(duì)于多種細(xì)胞因子聯(lián)系過(guò)程和鼻息肉的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)在不是很明確[1]。

細(xì)胞外基質(zhì)有過(guò)多的細(xì)胞集聚是鼻息肉組織形成的基礎(chǔ)。細(xì)胞外基質(zhì)組成基底膜，并且包繞和支持黏膜細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的合成和降解對(duì)于細(xì)胞的平衡非常重要。核轉(zhuǎn)錄因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在胞外信號(hào)的作用下其酪氨酸基團(tuán)被JAK（Janus Kinase，JAK）磷酸化，以二聚體的形式進(jìn)入胞核內(nèi)，與胞核中特異的基因片段相結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)。并在IL-6的刺激下參與Th17細(xì)胞的增殖活化，由STAT3介導(dǎo)下引起的Th17細(xì)胞反應(yīng)在哮喘等免疫及炎癥性疾病的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。

本研究從這點(diǎn)出發(fā)通過(guò)收集相關(guān)的臨床標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)p-STAT3及明膠酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在鼻息肉中的表達(dá)，初步探討它們?cè)诒窍⑷獍l(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，并分析它們之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料

收集2008年5月-2013年4月期間在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科住院期間行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者，共45例。其中鼻息肉組35例，男26例，女9例，年齡20～55歲，平均38歲；下鼻甲組10例，男8例，女2例，年齡17～42歲，平均32歲。所有患者無(wú)變應(yīng)性鼻炎、哮喘等病史，無(wú)服用類固醇皮質(zhì)激素、抗組胺藥物等病史。按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻喉科學(xué)分會(huì)關(guān)于慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型分期及內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（1997年，?？冢┓中停窍⑷饨M其中Ⅱ型1期9例，Ⅱ型2期18例，Ⅱ型3期3例，Ⅲ型5例。對(duì)照組（下鼻甲黏膜組）：均為慢性肥厚型鼻炎有雙側(cè)下鼻甲肥大患者。見(jiàn)表1。

1.2儀器及試劑

主要儀器：切片機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)、電子顯微鏡、病理組織包埋機(jī)等。主要試劑：鼠抗人STAT3多克隆抗體、鼠抗人MMP-2、9多克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒（SP-6000）、DAB顯色試劑盒等均來(lái)自北京中山生物有限公司。

1.3方法

術(shù)中收集標(biāo)本中性福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)病理檢查。免疫組織化學(xué)采用SP法按照說(shuō)明書進(jìn)行。將待用的石蠟切片取出后置于60℃的烤箱內(nèi)烤片，常規(guī)脫蠟入水，用PBS沖洗切片；抗原修復(fù)：修復(fù)時(shí)間為15～20 min。自然冷卻后PBS沖洗3遍；室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次；EDTA微波抗原修復(fù)，滴加非免疫性動(dòng)物血清，室溫下卵育10 min，倒去血清后，滴加一抗工作液（MMP-2、9或STAT3抗體稀釋液），切片分開滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜，0.01 MPBS沖洗3次。同時(shí)做陰性對(duì)照，控制條件與此前相同，只是用PBS溶液替代一抗。滴加生物素化二抗PBS液沖洗5 min 3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（S-A/HRP），DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以對(duì)應(yīng)的鼠抗人陰性IgG作為對(duì)照，以已知的陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4結(jié)果觀察

以高倍鏡和低倍鏡分別觀察p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況，每一切片均經(jīng)2位病理醫(yī)師進(jìn)行單盲法評(píng)估，并取平均值。陽(yáng)性細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核被染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，采用半定量方法確定陽(yáng)性結(jié)果及積分情況，在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多的視野進(jìn)行結(jié)果判定及評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75%為4分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，陰性為0分。棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分。兩個(gè)指標(biāo)相乘得分，所得結(jié)果＞3分即為陽(yáng)性。把所得結(jié)果分為4個(gè)等級(jí)：陰性（-）為0～2分，（+）為3～4分，（++）為6～8分，（+++）為9～12分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得結(jié)果用χ2檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1STAT3表達(dá)情況

p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色和棕褐色，周圍少許細(xì)胞呈淡

黃色表達(dá)（見(jiàn)圖1、2）。陽(yáng)性表達(dá)率為71.4%（25/35），在下鼻甲黏膜組織未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖3）。鼻息肉組中（+）5例,（++）7例,（+++）13例。鼻息肉組陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=31.96，P＜0.05）。（見(jiàn)表1）。

圖1 鼻息肉組織黏膜上皮STAT3表達(dá)，陽(yáng)性（×400）

圖2 鼻息肉組織腺體上皮STAT3表達(dá)，陽(yáng)性（×400）

圖3 正常下鼻甲黏膜STAT3表達(dá)，陰性（×400）

表1 STAT3在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達(dá)情況

2.2明膠酶表達(dá)情況

MMP-2陽(yáng)性表達(dá)主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色、棕褐色和淡黃色表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為68.6%（24/35），其中（+）10例，（++）8例，（+++）6例（見(jiàn)圖4）。下鼻甲組陽(yáng)性表達(dá)率為20%（2/ 10）（見(jiàn)圖5），其中（+）2例，鼻息肉組陽(yáng)性表達(dá)明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.54，P＜0.05）（見(jiàn)表2）；MMP-9陽(yáng)性表達(dá)主要在息肉黏膜及腺體上皮細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色和棕褐色表達(dá)（見(jiàn)圖6），陽(yáng)性表達(dá)率為82.9%（29/35），其中（+）7例，（++）12例，（+++）10例，下鼻甲組陽(yáng)性表達(dá)率為20%（2/10），其中（+）2例，鼻息肉組陽(yáng)性表達(dá)明顯高于下鼻甲組，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.36，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖4 鼻息肉組織中腺體上皮MMP-2表達(dá)陽(yáng)性（×400）

圖5 正常下鼻甲黏膜中MMP-2表達(dá)，陰性（×400）

2.3p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉中表達(dá)的相關(guān)性

鼻息肉組p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)25例，其中15例MMP-2陽(yáng)性表達(dá)，10例陰性表達(dá)；18例MMP-9陽(yáng)性表達(dá)，7例陰性表達(dá)。強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù)p-STAT3 20例；MMP-2 14例；MMP-9 22例。3組陽(yáng)性表達(dá)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)p-STAT3和MMP-9高于MMP-2。在p-STAT3陰性表達(dá)10例中有3例

MMP-2陽(yáng)性表達(dá)、5例MMP-9陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Spearman相關(guān)分析方法：p-STAT3與MMP-2之間：r=0.278，P＜0.05。P-STAT3和MMP-9之間：（r=0.312，P＜0.05），說(shuō)明p-STAT3與明膠酶之間存在正相關(guān)性關(guān)系。見(jiàn)表4。

表2 MMP-2在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達(dá)情況

圖6 鼻息肉組織中黏膜上皮MMP-9陽(yáng)性表達(dá)（×400）

表3 MMP-9在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表達(dá)情況

表4 鼻息肉組織中MMP-2、9表達(dá)和STAT3的相關(guān)性分析

3 討論

JAK-STAT（Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)炎癥因子從而影響病變過(guò)程，在正常調(diào)節(jié)下，這種途徑有通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)有積極的一面。STAT3與細(xì)胞增生及分化密切相關(guān)，活化的T細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。STAT3是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控許多腫瘤血管的形成、影響各種細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)，如明膠酶、VEGF、酪氨酸激酶Src等[3]。LINKE等[4]通過(guò)Western blot和免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)鼻息肉組STAT3-mRNA水平與下鼻甲組比較無(wú)差異性，但其數(shù)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)P-STAT3主要在下鼻甲組的表淺上皮層細(xì)胞表達(dá)，在間質(zhì)或上皮層基底細(xì)胞無(wú)表達(dá)情況，而鼻息肉組無(wú)論在上皮層還是間質(zhì)、基底細(xì)胞層都有表達(dá)現(xiàn)象。STAT3在鼻息肉增殖中發(fā)揮重要作用。

筆者采取免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)p-STAT3在鼻息肉組表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性表達(dá)率71.4%，以息肉黏膜上皮和腺體上皮細(xì)胞表達(dá)為主，在下鼻甲組織上皮中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)情況，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明p-STAT3在鼻息肉中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)研究表明STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺體的表達(dá)的陽(yáng)性率為66.67%，鼻息肉組STAT3表達(dá)明顯高于下鼻甲組33.33%（P＜0.01）。p-STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺體表達(dá)的陽(yáng)性率為56.67%，鼻息肉組p-STAT3表達(dá)明顯高于下鼻甲組43.33%（P＜0.01）[5]。

組織重塑近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)之一，細(xì)胞外基質(zhì)的降解和生成是組織的重建和病理過(guò)程。鼻息肉是上呼吸道的慢性炎癥疾病，組織特點(diǎn)為炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞的過(guò)度分化和組織重建，而細(xì)胞外基質(zhì)的增厚和水腫是導(dǎo)致鼻息肉形成和反復(fù)發(fā)作的基礎(chǔ)[6]。息肉中大量明膠酶的表達(dá)誘發(fā)基底膜膠原和明膠降解，伴隨大量微血管的增生和極有利于大分子物質(zhì)如纖維蛋白原通過(guò)，隨后發(fā)生血漿外滲增多，細(xì)胞外基質(zhì)蓄積，導(dǎo)致組織水腫，局部張力增加擠壓上皮，局部缺氧更易使上皮破裂，逐漸形成息肉[6]。

明膠酶包括MMP-2和MMP-9，能有效降解明膠和基底膜的主要成分Ⅴ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅸ型膠原，其高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜降解加速，在多種炎癥性和腫瘤性疾病致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)在鼻息肉中MMP-9的高表達(dá)可能破壞基底膜的膠原質(zhì)和上皮，導(dǎo)致血管通透性增加和間質(zhì)水腫。在鼻內(nèi)鏡鼻息肉手術(shù)后復(fù)發(fā)病例中有更多的MMP-9表達(dá)情況，說(shuō)明MMP-9在鼻息肉的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。

該研究中明膠酶MMP-2和MMP-9在鼻息肉組織中有高表達(dá)情況，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.6%和82.9%，明顯高于對(duì)照組下鼻甲組表達(dá)。MMP-2陽(yáng)性表達(dá)主要在鼻息肉黏膜和腺體上皮細(xì)胞質(zhì)，少許在細(xì)胞核，呈棕黃色、棕褐色和淡黃色表達(dá)，其強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)少于MMP-9，其中MMP-2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)為（+）10例，（++）8例，（+++）6例。MMP-9主要在息肉黏膜及腺體上皮細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色和棕褐色表達(dá)，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)（+）7例，（++）12例，（+++）10例。兩者陽(yáng)性表達(dá)率及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MMP-9陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)高于MMP-2，說(shuō)明MMP-9在鼻息肉組織表達(dá)敏感性高于MMP-2。陳江波等[7]研究指出MMP-9在復(fù)發(fā)組及嗜酸性粒細(xì)胞組鼻息肉的高表達(dá)，提示MMP-9可能通過(guò)增加嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜局部的浸潤(rùn)，影響了鼻息肉的預(yù)后。MMP-9可能作為鼻息肉復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子之一。

STAT3是在多種細(xì)胞因子相應(yīng)受體結(jié)合后，激活酪氨酸激酶，從而被其磷酸化，然后形成二聚體，再轉(zhuǎn)位至核中，與DNA上的靶基因結(jié)合，激活靶基

因的轉(zhuǎn)錄[3]。而明膠酶有可能在與p-STAT3聯(lián)系后被激活而發(fā)揮相應(yīng)作用。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉的黏膜和腺上皮中有高表達(dá)，而且明顯強(qiáng)于正常下鼻甲黏膜的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在鼻息肉組織中p-STAT3和MMP-2、9呈正相關(guān)性，說(shuō)明MMP-2、9在鼻息肉的發(fā)病過(guò)程中有重要的作用，阻斷p-STAT3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可下調(diào)明膠酶的表達(dá)，使鼻息肉的生長(zhǎng)減慢。因此，筆者認(rèn)為抑制p-STAT3蛋白通路可能有望成為一條治療鼻息肉的新途徑。

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（張蕾 編輯）

Expression and clinic function of STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyp tissue

Shu-jun SUN1,Li-min ZHAO1,Xian-bao YIN2
(1.Department of Otorhinolaryngology,the Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang,Shandong 261030,P.R.China;2.Department of Otorhinolaryngology,the Municipal Hospital of Zaozhuang,Zaozhuang,Shandong 277000,P.R.China)

【Objective】To observe the expression and clinical role of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in the tissue of nasal polyps and to investigate their relationship in the development of nasal polyps so as to provide help and new ideas for clinical treatment of nasal polyps.【Methods】The expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 were detected in the tissue of nasal polyps and inferior turbinate by routine pathologic and immunohistochemical methods.A total of 45 patients received nasal endoscopic surgery in the Department of Otorhinolaryngology of the Affiliated Hospital of Weifang Medical University from May 2008 to April 2013 (35 cases in nasal polyp group and 10 cases in the inferior turbinate mucosa group).【Results】The expression rates of MMP-2 and MMP-9 were 68.6%(24/35)and 82.9%(29/35)in the nasal polyp group and 20% (2/10)and 20%(2/10)in the inferior turbinate mucosa group,respectively.There was obvious difference between both groups(P＜0.05).The expression rate of p-STAT3 was 71.4%(25/35)and 0.0%in the nasal polyp group and the inferior turbinate mucosa group respectively,there was a statistical difference between both groups(P＜0.05).There were positive correlations between p-STAT3 and both MMP-2 and 9(r=0.278 and 0.312,P＜0.05).【Conclusions】The high expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyps and positive correlations illustrate they all play important roles in the pathogenesis of nasal polyps and can be used as markers of clinical treatment for nasal polyposis.

STAT3;MMP-2;MMP-9;nasal polyp;immunohistochemistry

R765.2

A

1005-8982（2015）27-0036-05

2015-04-14