腦缺血損傷后細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號通路及胡黃連苷Ⅱ的干預(yù)作用

周廣正，官亞東，張華，呂偉，付德利，翟麗

（青島大學醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

·論著·

腦缺血損傷后細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號通路及胡黃連苷Ⅱ的干預(yù)作用

周廣正，官亞東，張華，呂偉，付德利，翟麗

（青島大學醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

目的探討胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血損傷后細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）信號轉(zhuǎn)導通路的影響。方法成年健康雄性Wistar大鼠90只，隨機選擇15只為對照組，其余75只應(yīng)用線栓法建立大鼠腦缺血模型，經(jīng)腹腔注射胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg干預(yù)治療為胡黃連苷組。將成功的60只動物模型隨機分為模型組、治療組、脂多糖（LPS）組及U0126組，每組15只。用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）評價動物神經(jīng)行為功能，原位末端標記法（TUNEL）檢測細胞凋亡，Western blot檢測ERK1/2表達水平。結(jié)果大鼠腦缺血損傷后出現(xiàn)神經(jīng)行為功能障礙，皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量和pERK1/2蛋白表達較對照組明顯增多（P＜0.05）。胡黃連苷組和U0126組大鼠皮質(zhì)區(qū)凋亡細胞與pERK1/2表達較模型組明顯降低（P＜0.05），LPS組大鼠凋亡細胞與pERK1/2表達水平較高，但后期pERK1/2表達水平有所下降，動物神經(jīng)行為功能恢復(fù)。結(jié)論胡黃連苷Ⅱ可能通過降低ERK1/2磷酸化水平，抑制神經(jīng)細胞凋亡。

胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；凋亡；細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2；大鼠

細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）信號通路是絲裂原活化蛋白激酶通路的組成之一，介導細胞增殖、分化和凋亡等[1]。研究證實，腦缺血損傷可誘導神經(jīng)細胞凋亡，ERK1/2通路的激活能夠促進細胞的增殖、分化與修復(fù)，減輕神經(jīng)細胞損傷[2]。研究證明，ERK1/2通路在腦缺血損傷中能夠促進炎癥反應(yīng)及介導神經(jīng)細胞凋亡[3]。ERK1/2通路抑制劑U0126可抑制腦缺血大鼠ERK1/2通路的激活，保護血腦屏障損傷，緩解腦水腫[4]。本課題組研究證明，胡黃連苷Ⅱ在腦缺血損傷的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用，具有抗氧化、抗炎、減輕腦水腫、抑制神經(jīng)細胞凋亡、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子表達等神經(jīng)保護作用[5-7]。本實驗擬明確ERK1/2在腦缺血損傷后細胞凋亡中的作用，以及胡黃連Ⅱ?qū)RK1/2表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型

成年健康雄性Wistar大鼠90只，體重220～250 g，無特定病原體級，青島市藥品檢驗所實驗動物中心提供[SCXK（魯）20100010]。隨機選擇15只為對照組，其余75只應(yīng)用線栓法[8]經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立大腦中動脈阻塞模型。動物術(shù)前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉動物，仰臥位固定、無菌操作。將術(shù)后2 h死亡的15只大鼠剔除，改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）7～12分為模型成功的標志[9]。將成功的60只動物模型隨機分為模型組、治療組、脂多糖組及U0126組，每組15只。對照組動物除不插線進入顱內(nèi)外，其余操作同實驗組。

1.2干預(yù)措施

1.2.1胡黃連苷組將胡黃連苷Ⅱ（天津奎青有限公司）用生理鹽水配制成1%溶液，在缺血后2 h腹腔注射20 mg/kg。

1.2.2脂多糖將炎癥誘導劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（北京索萊寶科技有限公司）用生理鹽水溶液配制成1%溶液，在缺血后2 h腹腔注射LPS 20 mg/kg和胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg[10-12]。

1.2.3U0126組將ERK1/2通路抑制劑U0126-EtOH（美國Selleck公司）用10%二甲基亞砜配制成1%溶液，在缺血后2h腹腔注射U0126-EtOH 20mg/kg和胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg[10-12]。

1.2.4模型組和對照組同步腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3評價指標

1.3.1行為測試各組治療前（造模后2 h）和治療后（給藥后24 h）應(yīng)用mNSS評分評定動物神經(jīng)行為功能，最高18分，評分越高說明動物神經(jīng)行為功能損傷越重，反之則較輕微。

1.3.2原位末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）染色治療后每組隨機選取5只動物，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 ml，完整取腦，切取缺血部位腦組織100 mg提取總蛋白。其余腦組織置4%多聚甲醛后固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)脫水、透明、包埋，連續(xù)冠狀切片5μm，貼片。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按TUNEL凋亡檢測試劑盒（KGA7025-50assays，北京凱基生物公司）說明書進行操作，3、3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。光鏡下胞核有棕色顆粒者為凋亡細胞。陰性對照樣本不加末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶，不出現(xiàn)陽性著色。400倍顯微鏡下，每張切片隨機觀察皮質(zhì)區(qū)4個不重疊視野，細胞計數(shù)，取其均值。以凋亡細胞指數(shù)（凋亡細胞指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）表示損傷程度。

1.3.3Western blot檢測取缺血部位腦組織100mg，加細胞裂解液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）1 ml，4℃冰浴中研磨，置于4℃搖床30～60 min充分裂解，4℃、12 000 r/min離心15 min，去沉淀組織留上清液，二辛可寧酸（bicin chonininc acid，BCA）法測定蛋白濃度。取蛋白樣品20μg，應(yīng)用烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜，含吐溫-20℃的三羥甲基氨基甲烷氯化鈉緩沖液（tris-buffered saline containing tween-20，TBST）室溫封閉1 h，兔抗鼠磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylationextracellularsignal-regulatedkinase，pERK 1/2）單克隆抗體（1∶2 000）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，用HRP標記的羊抗兔二抗（1∶10 000）（美國Abcam公司）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。Vilber Fusion FX7化學發(fā)光多色熒光成像系統(tǒng)（法國Vilber公司）曝光顯影，Quantity one軟件分析各條帶灰度值。計算目的蛋白相對值，目的蛋白相對值=pERK1/2灰度值/ERK1/2灰度值。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組間比較用析因分析及最小顯著差數(shù)法，以P＜0.05為差

異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)行為功能

對照組動物活動正常，造模動物表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)行為功能障礙。治療組和U0126組的mNSS評分較治療前顯著下降（t=5.668和4.081，P＜0.05）。模型組和LPS組治療前后的mNSS評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.819和0.276，P＞0.05）。治療后，治療組mNSS評分較模型組和LPS組顯著下降（t=5.143和6.276，P＜0.01）；U0126組mNSS評分較模型組和LPS組亦顯著下降（t=2.368和2.812，P＜0.05）。模型組與LPS組，治療組與U0126組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.004和1.143，P＞0.05）。

2.2細胞凋亡

TUNEL染色顯示，各組大鼠神經(jīng)細胞有不同程度的凋亡，胡黃連苷組和U0126組表達顯著低于模型組（t=3.124和5.231，P＞0.05）。對照組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量較少；模型組大鼠皮質(zhì)區(qū)凋亡細胞明顯增多。胡黃連苷組大鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)少量凋亡細胞，各時間比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.043、 0.932和1.817，P＞0.05）。LPS組大鼠凋亡細胞比治療前略有下降（t=2.967，P＜0.01），但凋亡細胞仍然較多。U0126組大鼠皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)少量凋亡細胞，其程度最接近對照組，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（t= 0.936，P＞0.05）。見圖1。

圖1 大鼠皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡（TUNEL×400）

2.3Western blot檢測

胡黃連苷組和U0126組神經(jīng)細胞pERK1/2蛋白表達顯著低于模型組（P=3.025和2.436，P＜0.05）。對照組pERK1/2蛋白表達較治療前略高（t=2.012，P＞0.05）。治療后，模型組pERK1/2蛋白表達顯著高于其他各組（t=3.162、5.103、4.925和6.124，P＜0.01）。胡黃連苷組pERK1/2較治療前略有提高（t=1.893，P＞0.05），但與模型組比較顯著降低（t=4.171，P＜0.01）。治療后，LPS組pERK1/2表達仍高于胡黃連苷組和U0126組（t=5.362和4.324，P＜0.01）；U0126組pERK1/2水平較低。模型組與LPS組各時間pERK1/2表達較高，模型組顯著高于其他組（t=3.76、3.893、4.176和6.132，P＜0.01）；LPS組pERK1/2表達也顯著高于其他組（t=4.126、3.675、4.539和7.316，P＜0.01）。見圖2。

圖2 Western blot檢測ERK1/2蛋白表達

3 討論

腦中風后缺血區(qū)血流量急劇減少，神經(jīng)細胞受損，表現(xiàn)為壞死或者凋亡。實驗證實ERK1/2通路可以介導細胞凋亡[13]。SREEKANTH等[14]研究表明，登革熱病毒可激活小鼠肝細胞內(nèi)的ERK1/2，并且有大量細胞凋亡壞死，使用FR180204（一種ERK1/2選擇性抑制劑）后，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）表達顯著降低，凋亡細胞減少，肝細胞損傷明顯減輕。NAMURA等[15]實驗證實，U0126能夠降低前腦缺血或者局灶性缺血模型沙鼠的腦梗死面積，保護神經(jīng)系統(tǒng)，并且對缺氧環(huán)境中的原代皮質(zhì)神經(jīng)元細胞也表現(xiàn)出一定的保護作用。有報道證實，ERK1/2的激活可以直接導致神經(jīng)細胞的腫脹、壞死，而該過程獨立于Caspase家族的激活[16]。胡黃連味苦、性寒，有清熱、涼血、燥濕之功效。前期研究顯示，胡黃連苷Ⅱ能夠清除自由基、抗氧化[7]，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達，抑制Toll樣受體4-核轉(zhuǎn)錄因子κB信號轉(zhuǎn)導通路，緩解腦水腫、改善大腦的神經(jīng)功能[5]，同時下調(diào)Caspase-3表達，抑制腦缺血再灌注損傷誘導的細胞凋亡[6]。本實驗結(jié)果表明，腦缺血損傷后，皮質(zhì)缺血區(qū)神經(jīng)元ERK1/2激活，可以誘導細胞凋亡。治療組和抑制劑組治療后，缺血區(qū)神經(jīng)元ERK1/2激活顯著減少，細胞凋亡數(shù)量減少，從而促進神經(jīng)元細胞的恢復(fù)。而激動劑組使用胡黃連苷Ⅱ后，ERK1/2激活顯著減少，神經(jīng)元細胞有所恢復(fù)，但因其早期損傷較重，恢復(fù)較差。進一步提示腦缺血損傷后，ERK1/2通路的激活能夠介導神經(jīng)細胞凋亡，導致神經(jīng)元細胞死亡。胡黃連苷Ⅱ可能通過降低大鼠腦缺血損傷后ERK1/2的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡而保護神經(jīng)系統(tǒng)。

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（張蕾 編輯）

Effect of PicrosideⅡon ERK1/2 signal transduction pathway in rats with cerebral ischemic injury

Guang-zheng ZHOU,Ya-dong GUAN,Hua ZHANG,Wei LYU,De-li FU,Li ZHAI
(Institute of Integrative Medicine,Medical College,Qingdao University, Qingdao,Shandong 266021,P.R.China)

【Objective】To explore the effect of PicrosideⅡon ERK1/2 signal transduction pathway after cerebral ischemia injury in rats.【Methods】The focal cerebral ischemic model was established by inserting a monofilament thread into middle cerebral artery for occlusion in 90 Wistar rats.The rats in the treatment group were treated by intraperitoneal injection of PicrosideⅡ(20 mg/kg).The neurobehavioral function was evaluated by Modified Neurological Severity Score points test(mNSS).The apoptotic cells were counted by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling assay.The expression of pERK1/2 was determined by Western blot.【Results】After cerebral ischemia,the rats had neurological behavioral malfunction. As time progressed after cerebral ischemia,the apoptotic cells and the expression of pERK1/2 significantly increased compared to those in the control group(P＜0.05).The apoptotic cells and the expression of pERK1/2 in the treatment and U0126 groups were much lower than those in the model group(P＜0.05).In the LPS 6 h subgroup the apoptotic cells and the expression of pERK1/2 were the highest,and slightly recovered during the later period.【Conclusion】PicrosideⅡmight reduce cell apoptosis by inhibiting the activation of ERK1/ 2 in cerebral ischemic injury.

PicrosideⅡ;cerebral ischemia;apoptosis;ERK1/2;rat

R743.31；R285

A

1005-8982（2015）27-0022-05

2015-04-15

周廣正，青島大學在職碩士學位研究生，現(xiàn)工作單位為山東省菏澤市成武縣人民醫(yī)院