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    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的糖尿病大鼠胃平滑肌凋亡及大黃素干預(yù)作用*

    2015-12-08 07:48:57陳霞梅欣明徐瑲趙宏賢
    關(guān)鍵詞:排空內(nèi)質(zhì)網(wǎng)黃素

    陳霞,梅欣明,徐瑲,趙宏賢

    (1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學(xué)組織胚胎教研室,四川 瀘州 646000)

    ·論著·

    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的糖尿病大鼠胃平滑肌凋亡及大黃素干預(yù)作用*

    陳霞1,梅欣明2,徐瑲2,趙宏賢2

    (1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 瀘州 646000;2.四川醫(yī)科大學(xué)組織胚胎教研室,四川 瀘州 646000)

    目的探討糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡機(jī)制及大黃素干預(yù)機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組及大黃素組。造模10周時(shí)檢測(cè)胃排空;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、Caspase-12蛋白表達(dá)。結(jié)果①與對(duì)照組比較,糖尿病組大鼠胃內(nèi)色素殘留率顯著增高(P<0.05);與糖尿病組比較,大黃素組胃內(nèi)色素殘留率顯著下降(P<0.05)。②糖尿病組大鼠較對(duì)照組的胃平滑肌細(xì)胞凋亡、GRP78及Caspase-12蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05);與糖尿病組比較,大黃素組大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡、GRP78及Caspase-12蛋白表達(dá)顯著降低。結(jié)論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)途徑可能介導(dǎo)糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡。大黃素可能通過(guò)減少ERS介導(dǎo)的胃平滑肌細(xì)胞凋亡,改善糖尿病大鼠胃排空功能。

    大黃素;糖尿病胃輕癱;胃平滑??;凋亡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

    糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis,DGP)是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以胃排空延遲為主要特點(diǎn)的癥候群,臨床表現(xiàn)為早飽、腹脹、惡心、嘔吐等癥狀。有資料顯示,50%~76%的糖尿病患者存在胃排空異常[1]。近年研究發(fā)現(xiàn),DGP大鼠胃平滑肌凋亡增加[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress response,ERS)作為十分重要的第3條細(xì)胞凋亡途徑,參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。但是ERS是否介導(dǎo)糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。大黃素是中藥大黃主要活性成份,現(xiàn)代研究證實(shí)大黃素能夠明顯調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)[3-7],但具體機(jī)制有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病大鼠模型,檢測(cè)ERS是否參與糖尿病胃平滑肌細(xì)胞凋亡,以及大黃素對(duì)其干預(yù)作用,為DGP臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    清潔級(jí)雄性SD大鼠30只,6~8周,體重約200 g,由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供,許可證號(hào):川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第17號(hào)。

    1.2儀器與試劑

    J02005型722分光光度計(jì)(廈門(mén)分析儀器廠),One Touch Horion血糖儀(深圳強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司),鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司),大黃素(純度為98%,上海晶純有限公司),脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)試劑盒(瑞典Roche Diagnostics公司),葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、Caspase-12多克隆抗體(美國(guó)Bioword公司)。

    1.3方法

    1.3.1糖尿病造模SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。血糖正常大鼠30只,其中隨機(jī)選取10只健康SD鼠作為對(duì)照組,其余大鼠鏈脲佐菌素(streptozotosin,STZ)65 mg/kg腹腔注射以復(fù)制糖尿病模型;對(duì)照組給予等量檸檬酸緩沖液。3 d后,禁食不禁水6 h,采尾血測(cè)空腹血糖,以血糖持續(xù)1周≥16.7 mmol/L為造模成功。糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和大黃素組,每組10只。造模2周時(shí),對(duì)照組與糖尿病組以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)5 ml/kg灌胃,大黃素組用8 g/L大黃素混懸液灌胃,5 ml/kg,1次/d,連續(xù)8周。①一般指標(biāo):檢測(cè)進(jìn)食量、飲水量、尿量等,每周測(cè)體重1次。②血糖測(cè)定:STZ注射后第1、4、8和10周采尾血測(cè)空腹血糖。

    1.3.2胃排空檢測(cè)第10周,各組大鼠禁食不禁水24 h后,將1 mg/ml美藍(lán)溶液0.4 ml經(jīng)口胃管灌入,30 min后處死大鼠,取全胃。將胃內(nèi)殘留物用4 ml生理鹽水沖洗并收集沖洗液,低速離心機(jī)3 500 r/min離心15 min,取上清液,用722分光光度計(jì)在640 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值(optical density,OD)。大鼠胃排空用胃內(nèi)色素的殘留率表示,胃內(nèi)色素殘留率=測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×100%。

    1.3.3TUNEL法檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞凋亡按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色。切片放入3%雙氧水H2O2溶液中,室溫10 min。PBS洗滌樣片,將TdT及Biotin-dUTP混合液加至樣片,50μl/片,陰性對(duì)照只加Biotin-dUTP,50μl/片,加蓋玻片,37℃濕盒中孵育標(biāo)記60 min。以封閉液按照1∶50配置HRP為工作液,50μl加于樣品片,37℃盒中孵育標(biāo)記60 min,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑顯色,蘇木素染液復(fù)染胞核。TUNEL法陽(yáng)性結(jié)果判斷:細(xì)胞核棕黃(褐)色。每組取10個(gè)標(biāo)本,每個(gè)標(biāo)本1張切片,數(shù)碼顯微鏡照相,Image-proplus 5.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

    1.3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)GRP78、Caspase12蛋白表達(dá)胃平滑肌組織經(jīng)10%中性福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,二甲苯脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育10 min,蒸餾水沖洗3 min×3次,微波抗原修復(fù)20min。正常羊血清封閉,室溫孵育15min,加1∶100一抗體4℃過(guò)夜,PBS洗片5 min×3次,滴加生物素標(biāo)記二抗,37℃,20min,PBS洗片5 min× 3次,加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidinbiotin complex,SABC)液,37℃,20 min,PBS洗片5 min×3次,DAB顯色,自來(lái)水沖洗,脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察、照相。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照組。GRP78與Caspase12陽(yáng)性結(jié)果判斷:細(xì)胞質(zhì)著色,染成棕黃(褐)色。每組取10個(gè)標(biāo)本,每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片2張,數(shù)碼顯微鏡照相,Image-proplus 5.0圖

    像分析軟件分析蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1一般情況

    對(duì)照組大鼠一般情況良好。糖尿病組和大黃素組大鼠造模后第3天開(kāi)始出現(xiàn)多飲、多食、多尿;成模10周時(shí),兩組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、皮毛疏松無(wú)光澤、背部毛發(fā)部分脫落、少數(shù)極度衰竭,體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 10周時(shí)各組大鼠體重與血糖濃度比較(n=10±s)

    表1 10周時(shí)各組大鼠體重與血糖濃度比較(n=10±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與糖尿病組比較,P<0.05

    組別體重/g血糖濃度/(mmol/L)對(duì)照組465.00±19.005.38±1.20糖尿病組172.50±29.561)28.63±4.501)大黃素組178.30±17.741)21.51±9.451)2)F值541.45738.477

    2.2血糖濃度測(cè)定

    造模3 d后,模型組和大黃素組空腹血糖始終維持>16.7 mmol/L。成模10周時(shí),與對(duì)照組比較,模型組和大黃素組大鼠血糖顯著增加(P<0.05);與模型組比較,大黃素組大鼠血糖顯著降低(P<0.05),但未降至正常水平。見(jiàn)表1。

    2.3胃內(nèi)色素殘留率測(cè)定

    糖尿病大鼠胃內(nèi)美藍(lán)殘留率顯著高于對(duì)照組(F=85.366,P<0.05)。與糖尿病組比較,大黃素組胃內(nèi)美藍(lán)殘留率顯著降低(F=85.366,P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 各組胃內(nèi)色素殘留率與胃平滑肌細(xì)胞凋亡率比較(n=10,%±s)

    表2 各組胃內(nèi)色素殘留率與胃平滑肌細(xì)胞凋亡率比較(n=10,%±s)

    注:1)與對(duì)照組比較,P<0.05;2)與糖尿病組比較,P<0.05

    組別色素殘留率細(xì)胞凋亡率對(duì)照組38.68±1.772.54±1.30糖尿病組51.81±2.601)11.65±3.301)大黃素組42.89±2.461)2)6.50±1.971)2)F值85.36657.043

    2.4胃平滑肌細(xì)胞凋亡率

    糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(F=57.043,P<0.05)。與糖尿病組比較,大黃素組胃平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(F=57.043,P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

    圖1 各組胃平滑肌細(xì)胞凋亡(TUNEL×400)

    2.5胃平滑肌細(xì)胞GRP78、Caspase12蛋白表達(dá)

    與對(duì)照組比較,糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞GRP78 [(6.51±2.12)vs(20.21±3.56)]、Caspase12[(6.48± 2.11)vs(18.91±4.61)]蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著增多(F=47.809、35.910,P=0.000)。與糖尿病組比較,大黃素干預(yù)大鼠胃平滑肌細(xì)胞GRP78[(20.21±3.56)vs(12.04±3.55)]、Caspase12[(18.91±4.61)vs(12.92± 2.55)]蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯著減少(F=47.809、35.910,P=0.000)。見(jiàn)圖2、3。

    圖2 各組胃平滑肌細(xì)胞GRP78蛋白陽(yáng)性表達(dá)(SABC×200)

    圖3 各組胃平滑肌細(xì)胞Caspase12蛋白陽(yáng)性表達(dá)(SABC×200)

    3 討論

    胃輕癱除導(dǎo)致上消化道癥狀外,還影響糖尿病患者的血糖控制。本實(shí)驗(yàn)在造模10周的檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠胃內(nèi)色素殘留率增加,表明胃排空能力明顯減弱。DGP的發(fā)病機(jī)制尚未明確。近來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn),糖尿病可導(dǎo)致不同部位的細(xì)胞凋亡,胃腸平滑肌也不例外。本研究中TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明,糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡增多,與相關(guān)研究結(jié)果一致[2]。

    近年來(lái)研究結(jié)果證明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在把控細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮重要作用。感染因素、環(huán)境因素、不利的代謝條件等都可以干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能,破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),達(dá)到一定程度便會(huì)產(chǎn)生ERS。GRP78是ERS的一種標(biāo)志蛋白,GRP78的表達(dá)常提示ERS的存在,其在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)合成、正確折疊及細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GRP78蛋白在糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高,提示糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞存在ERS。

    本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡與ERS的相關(guān)性。在ERS介導(dǎo)的凋亡途徑中,Caspase-12起至關(guān)重要作用。Caspase-12以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè),是特異性ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)子,在ERS時(shí)可特異性激活,非ERS介導(dǎo)的凋亡無(wú)Caspase-12活化[9]。本研究結(jié)果顯示,糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞Caspase-12蛋白表達(dá)增強(qiáng),Caspase-12相關(guān)的凋亡往往與ERS途徑有關(guān)。提示ERS途徑在糖尿病大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡中起一定作用。糖尿病大鼠體內(nèi)存在多種可誘發(fā)ERS的因素,如氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝障礙。筆者推測(cè),糖尿病患者由于多種不利因素導(dǎo)致ERS,促進(jìn)細(xì)胞凋亡重要調(diào)節(jié)因子——Caspase-12的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,引起胃排空功能減低。

    除此之外,本研究顯示,應(yīng)用大黃素的大鼠胃排空能力明顯提高。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃素能夠明顯調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),大黃素可通過(guò)離子通道、起搏細(xì)胞、神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素與炎癥反應(yīng)的環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的收縮與舒張。但未見(jiàn)從平滑肌細(xì)胞凋亡角度,探討大黃素對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)影響的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),大黃素干預(yù)組大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡及Caspase-12蛋白表達(dá)較糖尿病組降低,提示大黃素有可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERS途徑,減少胃平滑肌細(xì)胞凋亡,改善糖尿病大鼠胃平滑肌的生理功能,從而改善胃排空能力。

    [1]CHOUNG RS,LOCKE GR,SCHLECK CD,et al.Risk of gastroparesis in subjects with type 1 and 2 diabetes in the general population[J].Am J Gastroenterol,2012,107(1):82-88.

    [2]CHEN X,FU XS,LI CP,et al.ER stress and ER stress-induced apoptosis are activated in gastric SMCs in diabetic rats[J]. World J Gastroenterol,2014,20(25):8260-8267.

    [3]譚曉虹,李煒,王志寶,等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選虎杖中大黃素的提取工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(7):1703-1704.

    [4]PENG C,WANG L,WANG YH,et a1.The toxicity of aconitine, emodin on ICC cell and the antagonist efect of the compatibility [J].Eur J Drug Metab Pharmacokinet,2009,34(3):213-220.

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    [8]SU YC,WU JL,HONG JR.Betanodavirus upregulates chaperone GRP78 via ER stress:roles of GRP78 in viral replication and host mitochondria-mediated cell death[J].Apoptosis,2011,16(3): 272-287.

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    (張蕾 編輯)

    Endoplasmic reticulum stress induced apoptosis in gastric smooth muscle cells in diabetic rats and effects of Emodin intervention*

    Xia CHEN1,Xin-ming MEI2,Qiang XU2,Hong-xian ZHAO2
    (1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital,Luzhou Medical College,Luzhou, Sichuan 646000,P.R.China;2.Department of Histology and Embryology,Sichuan Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

    【Objective】To investigate the mechanism of apoptosis of gastric smooth muscle cells(SMCs) in diabetic rats,and the mechanism involving the effect of Emodin on SMCs in diabetic rats.【Methods】SD rats were randomly divided into control group,diabetic group and Emodin group.Gastric emptying was determined in the 10th week.Apoptosis of gastric SMCs was detected by TUNEL method.Expressions of glucoseregulated protein 78(GRP78)and Caspase-12 protein were detected by immunohistochemistry.【Results】①The rate of gastric residual pigment was significantly increased in the diabetic group than in the control rats (P<0.05).Compared with the diabetic group,the rate of gastric residual pigment was significantly decreased in the Emodin group(P<0.05).②The cell apoptosis and the expressions of GRP78 and Caspase-12 protein in gastric smooth muscle cells were obviously increased in the diabetic group than in the control group(P<0.05).Compared with the diabetic group,the cell apoptosis and the expressions of GRP78 and Caspase-12 protein in gastric smooth muscle cells were declined obviously in the Emodin group(P<0.05).【Conclusions】Emodin can improve the gastric emptying,which may be involved with the reduction of apoptosis of gastric

    Emodin;gastroparesis;gastric smooth muscle;apoptosis;endoplasmic reticulum stress

    R587.1;R-332

    A

    1005-8982(2015)27-0018-04

    2015-02-17

    四川省瀘州市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目[No:2009-S-15(5/7)];四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No:100242)

    趙宏賢,E-mail:zilong5276@sohu.com

    SMCs in diabetic rats induced by endoplasmic reticulum(ER)stress pathway.

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