血管生成素及其受體Tie2在白血病中的研究現(xiàn)狀

董春娟，徐勇勝

天津市兒童醫(yī)院呼吸科，天津 300074

血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上新血管高度有序形成的過程。研究發(fā)現(xiàn)白血病患者骨髓微血管密度增加，說明血管新生也參與了白血病的發(fā)生。血管新生受多種細胞因子的調(diào)控，其中血管生成素(Angiopioetin， Ang)及其受體Tie2(tyrosine kinase receptor with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domain-2)在腫瘤血管新生中具有調(diào)節(jié)血管穩(wěn)定、成熟和重建的作用。本文就近年Ang/Tie2在白血病中的研究進展做一概述。

Ang及其受體Tie2是近年來發(fā)現(xiàn)的血管生成調(diào)節(jié)因子。Ang家族由血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)、血管生成素-3(Ang-3)、血管生成素-4(Ang-4)組成，與受體Tie2結(jié)合后參與血管新生。Ang-1主要由血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)和管周細胞分泌，廣泛表達于全身各組織。Tie2為酪氨酸激酶受體，Ang-1與Tie2結(jié)合后引起酪氨酸激酶磷酸化，進而發(fā)揮Ang-1維持新生血管穩(wěn)定，促進新生血管成熟的作用[1]。Ang-2 亦由VEC和管周細胞分泌，在血管靜止區(qū)域幾乎不表達，而在血管重建區(qū)(如胎兒肝臟、成人卵巢、子宮、腫瘤組織等)高表達。Ang-2是Ang-1的天然拮抗劑，能抑制Ang-1的功能，Ang-2 與Tie2結(jié)合后不能引起酪氨酸激酶磷酸化，從而導(dǎo)致血管退化[2]。另一方面，Ang-2能破壞VEC與細胞外基質(zhì)的相互作用，使不穩(wěn)定狀態(tài)的VEC對生長因子的敏感性增加，從而加強了血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)等細胞因子的促血管生成作用。因此，在僅有Ang-2存在時，血管發(fā)生退化，血管數(shù)目減少，同時伴有VEC的凋亡和血管平滑肌細胞的斷裂；在Ang-2與VEGF同時存在時，血管數(shù)目增加，VEC增生活躍，血管壁通透性增加[3]。然而在特定的組織微環(huán)境和實驗條件下，Ang-2與Ang-1一樣起Tie2激動劑的作用[4]。Ang-3為鼠源性血管生成素，Ang-4主要在肺內(nèi)表達[5]。酪氨酸激酶受體Tie2表達于內(nèi)皮細胞、部分造血干細胞、造血祖細胞及腫瘤細胞等多種細胞。Tie2在血管重建區(qū)和血管靜止區(qū)域均存在，說明其在血管新生和新血管穩(wěn)定中均發(fā)揮作用，且缺氧和炎癥性細胞因子都能誘導(dǎo)Tie2在VEC中表達[6]。研究發(fā)現(xiàn)Ang/Tie2在多種實體瘤中均表達，并且與腫瘤的侵襲、預(yù)后等因素相關(guān)[3]。最近研究證實，Ang/Tie2在白血病中亦表達并且與白血病的細胞形態(tài)、免疫分型、核型及預(yù)后等因素相關(guān)。

Ang及其受體在白血病中的表達：Muller等[7]用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測了白血病細胞系和患者標(biāo)本中Ang-1、Tie2的mRNA水平，6種髓系白血病細胞系中4種高表達Ang-1；與正常對照相比，11例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AMl)患者標(biāo)本中，9例高表達Ang-1，7例高表達Tie2；6例慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者標(biāo)本中，4例高表達Ang-1，6例高表達Tie2；所有外周血原始細胞大于20%的患者標(biāo)本中均能檢測到Ang-1的表達，而5例完全緩解的髓系白血病，4例淋巴系白血病及正常對照均未檢測到Ang-1及其受體的表達。zhang等應(yīng)用RT-PCR方法檢測60例AMl患者外周血單個核細胞Ang-2表達，發(fā)現(xiàn)Ang-2 mRNA表達水平明顯高于正常對照組[8]。

Ang及其受體與白血病細胞形態(tài)、核型及免疫分型的關(guān)系：Watarai等[9]用RT-PCR檢測了36例AMl患者Ang-1、Ang-2、Tie2的表達，其中27例患者表達Ang-1、12例表達Ang-2、15例表達Tie2；Tie2在FAB分型的M2、M4、M5中高表達，而在M1、M3中低表達；Ang-2在CD7(+)的AMl患者中較CD7(-)的AMl患者表達高，而其他免疫表型如CD34、CD19、CD13、CD33均不影響Ang及其受體的表達；Ang-2在伴t(8;21)的AMl患者中較不伴該染色體畸變的患者表達低。Riccioni等[10]檢測了111例AMl患者Tie2蛋白的表達情況，Tie2表達于59%的病例，其中22%的病例Tie2表達明顯增加；Tie2(+)的AMl患者大多表達單核細胞的膜標(biāo)記如CD14、CD11b、CD36，以及巨噬細胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor recepter，M-CSFR)，F(xiàn)AB分型多為M4、M5a、M5b；Tie2(+)的AMl患者初診白細胞數(shù)較Tie2(-)的患者明顯升高，且fms樣酪氨酸激酶3(fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)lt-3)表達高，突變率高；伴有inv(16)染色體異常的AMl患者大部分高表達Tie2。最近Hatfield等[11]培養(yǎng)91例AMl患者的原始細胞，其中62例患者細胞培養(yǎng)上清中檢測到Ang-1的表達，23例患者檢測到Ang-2的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)，伴有核磷蛋白(nucleophosmin1，NPM1)突變的細胞Ang-1表達明顯增加。綜上所述，Ang及其受體在M4、M5中表達高，并且與初診時高白細胞，t(8; 21)、inv(16)等核型異常，以及Flt-3、NPM1突變等相關(guān)。

Ang/Tie2在白血病中發(fā)揮作用的機制：Ang/Tie2在管新生中主要通過激活下游磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3-K)途徑，活化絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt，發(fā)揮抗凋亡作用， 促進VEC生長[12]。Ang/Tie2在白血病中是否也是通過PI3-K途徑發(fā)揮作用，不少學(xué)者對此進行了研究。Watarai等[9]研究發(fā)現(xiàn)CD7(+)AMl細胞高表達Ang-2，且在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells)中存活時間長，因此推測Ang-2通過旁分泌作用于內(nèi)皮細胞上的受體，促進血管新生來進一步“飼養(yǎng)”白血病細胞。在白血病細胞培養(yǎng)液中，特別是Tie2(+)白血病細胞中能檢測到Ang-1的表達，但白血病細胞與阻斷Ang-1/Tie2途徑的抑制劑共培養(yǎng)后，細胞凋亡增加，這表明Ang-1/Tie2能促進白血病細胞的生長[10]。Wakabayashi等[13]應(yīng)用Tie2-Fc段抑制Ang與Tie2受體結(jié)合，觀察Tie2-Fc對AMl細胞生長的影響。19例患者標(biāo)本中，9例患者AMl細胞生長未受Tie2-Fc的抑制，被歸為A組；10例患者AMl細胞生長明顯受抑制，被歸為B組。同樣PI3-K抑制劑LY294002不能抑制A組AMl細胞生長，但能明顯抑制B組AMl細胞生長，而且LY294002和Tie2-Fc對AMl細胞生長的抑制程度具有一致性。該結(jié)果也在細胞系中得到進一步證實，KG-1細胞的生長能被Tie2-Fc和LY294002抑制，而HL-60細胞的生長不受抑制。該實驗說明，部分AMl細胞依賴Ang/Tie2生長，并且Ang/Tie2依賴下游的PI3-K途徑，促進細胞生長，抑制凋亡。

Ang及其受體對白血病預(yù)后的意義：研究證實，多種臨床或生物學(xué)因素如年齡、核型、Flt-3和NPM1等基因突變、對誘導(dǎo)治療的反應(yīng)等均影響AMl的預(yù)后[14]。近來Ang及其受體對白血病預(yù)后的影響引起了諸多研究者的興趣。Loges等[15]用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測90例AMl患者外周血單個核細胞Ang-1、Ang-2、Tie2 和VEGF mRNA水平及其與預(yù)后的關(guān)系，多因素分析表明Ang-2及對誘導(dǎo)治療的反應(yīng)是總體生存率的獨立預(yù)后因素，高表達Ang-2者預(yù)后好，尤其是對VEGF低表達的患者。Schliemann等[16]用免疫組織化學(xué)法檢測AMl患者骨髓活檢標(biāo)本中Ang-1、Ang-2、Tie2蛋白的表達，與正常對照相比，Ang-1表達無差別，Ang-2、Tie2表達增高；進一步研究表明Ang-2高表達組總體生存率更高，特別是在Ang-1低表達組，Ang-2對預(yù)后的影響更明顯，而在Ang-1高表達組，Ang-2對預(yù)后的影響不明顯。然而，Hou等[17]用qPCR檢測126例AMl患者骨髓單個核細胞Ang-1、Ang-2、Tie2和VEGF的表達，并分析各因素對預(yù)后的影響，多因素分析顯示Ang-2是總體生存率的獨立不良預(yù)后因素，特別是在中危核型組Ang-2對預(yù)后的影響顯著，而在低危和高危核型組則不明顯；且Ang-2對預(yù)后的影響在Ang-1或Tie2低表達、VEGF高表達患者中有意義。最近Kümpers等[18]分析了循環(huán)中Ang-2水平對高危AMl患者異基因造血干細胞移植后預(yù)后的影響，移植前循環(huán)中Ang-2高的白血病患者異基因造血干細胞移植后無病生存率低，且移植前Ang-2水平是異于其他已知因素(如骨髓浸潤程度，移植前化療次數(shù))的獨立預(yù)后因素。Zhang等[8]應(yīng)用RT-PCR方法檢測AMl患者外周血單個核細胞Ang-1、Ang-2、Tie2和VEGF mRNA水平及其與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ang-2及是AMl患者總體生存率的獨立不良預(yù)后因素，而Ang-1和Tie2對總體生存率無影響。同時Koenecke等[19]發(fā)現(xiàn)移植前AMl患者血清中可溶性Tie2及Ang-2的水平較正常對照明顯增高，且可溶性Tie2為移植后復(fù)發(fā)的獨立危險因素，特別是可溶性Tie2和Ang-2同時升高者總體生存率更低。Aref等[20]發(fā)現(xiàn)Ang-2高表達AMl患者總體生存率低，而Ang-2/Tie2比例是AMl患者獨立不良預(yù)后因素。

上述幾組實驗結(jié)果截然相反，其原因一方面可能是患者樣本存在差異，另一方面可能由于所用實驗技術(shù)不同。Loges等用qPCR檢測外周血原始細胞Ang/Tie2的表達，Schliemann等用免疫組織化學(xué)法檢測骨髓活檢標(biāo)本，而Hou等用qPCR檢測骨髓單個核細胞，Kümpers等用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中的Ang-2。然而，從另一角度看相反的實驗結(jié)果卻有共同之處，Loges等和Hou等的實驗結(jié)果說明Ang和VEGF相互作用的重要性。如果將患者標(biāo)本分成VEGF高表達組和低表達組，Hou等的實驗結(jié)果表明，在VEGF高表達組Ang-2是不良預(yù)后因素，而在VEGF低表達組Ang-2預(yù)后意義不顯著；Loges等的結(jié)果顯示，Ang-2和VEGF均高表達的患者比Ang-2高表達而VEGF低表達的患者預(yù)后差。由此可見，Ang-2和VEGF兩種細胞因子同時作用時患者預(yù)后較差[8,21]。

慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一組有著不同病程的異質(zhì)性的疾病，多種預(yù)后因素決定CLL臨床病程和轉(zhuǎn)歸，免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因無突變(unmutated immunoglobulin heavy chain variable region，unmutated IgVH)、ZAP-70(+)(70-kDa zeta-associated protein)或CD38(+)均是獨立不良預(yù)后因素[22,23]。一些學(xué)者研究了Ang-2對CLL預(yù)后的意義，發(fā)現(xiàn)處于Binet分期B、C期的患者Ang-2表達高于A期患者，并且ZAP-70(+)CD38(+)的CLL患者比ZAP-70(-)CD38(-)的CLL患者高表達Ang-2[24]。另一些學(xué)者證實，Ang-2高表達的CLL患者臨床分期較晚，CD38(+)和unmutated IgVH細胞百分比較高，不良預(yù)后核型較多見，無進展生存期較短[25]。Binet A期的CLL患者中30%表達Ang-2，Ang-2的表達與骨髓微血管密度有顯著相關(guān)性；診斷時Ang-2高表達的患者疾病進展快，需要早期治療，無進展生存率低[26-28]。這些研究表明，Ang-2不僅反映了CLL腫瘤負荷，也反映了腫瘤的惡性程度，Ang-2高表達的患者惡性程度更高，進展更快。

展望：Ang/Tie2在白血病中異常表達，并且與白血病的細胞形態(tài)、免疫分型、核型及預(yù)后等因素相關(guān)，是白血病治療的潛在靶點。臨床1、2期試驗顯示，沙利度胺和兩種小分子酪氨酸激酶抑制劑(SU5416和SU11248)能明顯降低原發(fā)和復(fù)發(fā)難治白血病患者的骨髓微血管密度[29-31]。而Ang-2選擇性阻斷劑能顯著抑制鼠結(jié)腸癌標(biāo)本的血管新生[32]。最近，針對Ang的重組Fc片段在進展期實體瘤中的臨床1期評價工作也已完成(www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00102830)。綜上所述，研究Ang/tie2在白血病中的表達及其病理生理機制，將有利于白血病治療的進展。

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