SCC/XPC復(fù)合體在體細(xì)胞重編程中的作用

陳嬋嬋 綜述;凌均棨 審校

(中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510055)

XPC復(fù)合體由Xeroderma pigmentosum group C－RAD23B－Centrin2(XPC－RAD23B－CETN2)元件組成，是一個(gè)由多亞單位組成的核酸切除修復(fù)復(fù)合體(nucleotide excision repair complex，NER)，具有DNA損傷修復(fù)功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，XPC可作為輔助激活復(fù)合體(stem cell coactivator complex，SCC)輔助 Oct－4、Sox2 激活 Nanog，從而維持胚胎干細(xì)胞(ESCs)的特性和提高成纖維細(xì)胞的重編程效率［1］。這一發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stemcells，iPSCs)研究領(lǐng)域具有重要意義。本文就SCC/XPC的相關(guān)研究作一綜述。

1 SCC/XPC的結(jié)構(gòu)組成及功能

SCC/XPC復(fù)合體是一種由XPC與RAD23B、CETN2結(jié)合而形成的三聚體。XPC是著色性干皮病的7個(gè)互補(bǔ)群(XP)之一，人類的XPC基因編碼含有940個(gè)氨基酸的堿性蛋白(理論P(yáng)I∶9.03)，分子量均為106 kDa［2］。XPC的部分功能結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確認(rèn)，包括 RAD23B、CETN2、DNA和轉(zhuǎn)錄因子(TFIIH)綁定域;這些結(jié)構(gòu)域靠近C－端與Rad4p為高度同源序列，并可進(jìn)一步分為4個(gè)子域:1個(gè)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同系域(TGD)和3個(gè)連續(xù)的β－發(fā)束樣域(BHD1，2，3)［3］。但其 N － 端的功能目前尚不明確。純化的XPC具有識(shí)別和結(jié)合于各種明確的DNA損傷的能力，即:XPC可通過(guò)識(shí)別體積龐大的畸形螺旋結(jié)構(gòu)而識(shí)別損傷的 DNA，并募集TFIIH到損傷位置啟動(dòng)總基因組核苷酸切除修復(fù)(GG－NER)［4］。此外，XPC 還可與其他蛋白相互作用，但其功能尚不完全明確。Lubin等［5］研究發(fā)現(xiàn)，與XPC相互作用的49個(gè)因子均分別與DNA的修復(fù)和復(fù)制、蛋白水解、翻譯后修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝有關(guān)。

RAD23具有DNA損傷修復(fù)和構(gòu)成泛素－蛋白酶體系的兩種截然不同的功能，并可通過(guò)與蛋白酶體和泛素相互作用，參與蛋白降解過(guò)程。人RAD23家族包括RAD23A和RAD23B，均含有2個(gè)可綁定4～6個(gè)基團(tuán)聚泛素鏈的泛素結(jié)合域和一個(gè)與26S蛋白酶體作用的氨基末端泛素樣域［6－7］。RAD23A和 RAD23B的功能可相互補(bǔ)償，但RAD23A只能在非 NER 功能上補(bǔ)償 RAD23B［8］。人體內(nèi)XPC大多與RAD23B結(jié)合，RAD23B的表達(dá)量多于 RAD23A，且總量遠(yuǎn)大于 XPC;提示，RAD23具有GG－NER外的其他功能，可能與調(diào)節(jié)蛋白降解相關(guān)［9］。另有研究顯示，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)缺乏RAD23B時(shí)會(huì)導(dǎo)致其增殖速率降低和紅細(xì)胞生成缺陷［8］。RAD23A/B在體內(nèi)和體外均能通過(guò)阻止XPC被泛素－蛋白酶體系降解而起到穩(wěn)定SCC/XPC復(fù)合體的作用，是SCC/XPC復(fù)合體修復(fù)功能的關(guān)鍵因素。

CETN2是作為中心粒蛋白被發(fā)現(xiàn)的，它是一種小的鈣結(jié)合蛋白，屬于鈣調(diào)節(jié)蛋白超家族，在中心粒的復(fù)制和增殖中起關(guān)鍵作用。CETN2含有4個(gè)EF－基序，XPC C－端的一個(gè)α螺旋可通過(guò)疏水基與CETN2結(jié)合［10］;其功能在于加強(qiáng)XPC對(duì)損傷DNA的特異性和親和力。

2 SCC/XPC復(fù)合體的輔助激活功能

以往對(duì)SCC/XPC的研究主要集中在其GGNER 功能。2011年，F(xiàn)ong等［1］首次提出 Oct4/Sox2上游啟動(dòng)元件—多亞單位干細(xì)胞輔激活因子復(fù)合體(stem cell coactivator complex，SCC)的概念，并發(fā)現(xiàn) SCC 可輔助 Oct－4、Sox2 激活 Nanog，調(diào)控下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，啟動(dòng)細(xì)胞重編程，從而有效提高細(xì)胞的自我更新能力和重編程效率;hIP－qPCR檢測(cè)結(jié)果提示，70%SCC/RAD23B靶基因與Oct－4/Sox2靶基因重疊;SCC干擾可造成小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)異常、堿性磷酸酶活性降低、細(xì)胞增殖速率減慢，從而使細(xì)胞的自我更新能力受到影響，持續(xù)的抑制還會(huì)引起細(xì)胞分化并凋亡。

Ito等［11］發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞的 XPC C－端被誘導(dǎo)敲除后，仍能保持其干細(xì)胞特性;基因表達(dá)譜分析表明，XPC的C－端丟失對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞基因組表達(dá)的影響甚微，對(duì)Oct3/4基因表達(dá)幾乎無(wú)影響，說(shuō)明XPC的 C－端對(duì)于激活小鼠胚胎干細(xì)胞Oct4/Sox2的轉(zhuǎn)錄活性是非必要的;該實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，XPC、RAD23B和 CETN2三聯(lián)或二聯(lián)干擾均可引起NanogmNRA的表達(dá)量明顯減少，而單獨(dú)敲除也只引起微弱的變化，同時(shí)也沒(méi)有明顯的自我更新缺陷。體外轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)顯示，XPCRAD23B二聚體具有與全復(fù)合體幾乎相同的轉(zhuǎn)錄激活功能，提示XPC和RAD23B是最小的活性單位，CETN2可能通過(guò)提供結(jié)構(gòu)支持和增加穩(wěn)定性來(lái)加強(qiáng)復(fù)合體的活性;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，干擾和敲除XPC和 CETN2并不影響 MEFs的增殖，而當(dāng)RAD23B的表達(dá)受到抑制時(shí)，才會(huì)使MEFs的生長(zhǎng)速率出現(xiàn)明顯異常，這可能與其引起細(xì)胞的重編程效率降低有關(guān)［1］。

SCC/XPC的輔助激活功能與NER功能機(jī)制不同，前者可通過(guò)直接與 Oct4和 Sox2相互作用，并作為轉(zhuǎn)錄輔因子而發(fā)揮功能，且不需要XPC介導(dǎo)的 DNA或 TFIIH綁定。有研究顯示，XPC C－端失效的SCC復(fù)合體具有與野生型等效價(jià)的輔助Oct－4、Sox2激活 Nanog的功能，提示其轉(zhuǎn)錄輔助激活功能與其DNA綁定功能是彼此獨(dú)立的［1］。May等［12］發(fā)現(xiàn)，在 Hela 細(xì)胞 DNA 轉(zhuǎn)錄的起始未受到外源性有害刺激的情況下，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄機(jī)依次可將NER因子募集到啟動(dòng)子位置，這種募集具有 XPC蛋白依賴性;作者認(rèn)為，NER因子在啟動(dòng)子上的出現(xiàn)與其在基因末端不同，后者為基因修復(fù)功能，前者與轉(zhuǎn)錄有關(guān)，并推測(cè)SCC可能有助于染色質(zhì)的識(shí)別從而促進(jìn)表觀遺傳構(gòu)建以利于iPSCs的轉(zhuǎn)變。Fong等［1］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SCC缺失時(shí)可直接抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄功能和重編程能力，表現(xiàn)為p53的表達(dá)上調(diào)、Nanog表達(dá)受到抑制、細(xì)胞的自我更新能力下降，并出現(xiàn)自發(fā)性分化與細(xì)胞凋亡。

Krzeszinski等［13］研究表明，XPC 可通過(guò) MDM2介導(dǎo)p53的降解，XPC則與RAD23B形成穩(wěn)定的化合物(后者含有2個(gè)分別與泛素和蛋白酶體結(jié)合的功能域);在此過(guò)程中MDM2先識(shí)別泛素鏈標(biāo)記的 p53，然后再與 XPC結(jié)合并募集XPCRAD23B復(fù)合體到p53泛素化位點(diǎn)，進(jìn)而協(xié)助p53被RAD23B識(shí)別，同時(shí)通過(guò)RAD23B－蛋白酶體相互作用而促使泛素化物被蛋白體酶降解。另有研究發(fā)現(xiàn):在人胚胎干細(xì)胞中，p53的激活能引起miR－34a和miR－145的表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)而抑制胚胎干細(xì)胞中調(diào)控因子 Oct4、Sox2、Klf4、Lin28a的表達(dá)［14］;在 MEFs重編程過(guò)程中，p53可通過(guò)激活miR－34a、b、c而抑制內(nèi)源性重編程基因 Sox2、Nanog、nMyc的表達(dá)［15］。根據(jù)以上研究結(jié)果推測(cè)，SCC的輔助激活調(diào)控機(jī)制可能為:XPC通過(guò)MDM2的介導(dǎo)和RAD23B的參與導(dǎo)致p53被泛素－蛋白酶體系降解，降低了 p53－miRs對(duì)重編程因子Oct4、Sox2、Klf4、Lin28a 的抑制作用，最終使細(xì)胞的重編程效率提高。

3 牙髓iPSCs研究進(jìn)展及SCC/XPC在該領(lǐng)域的研究前景

Tamaoki等［16］(2010)成功將 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞(hDPCs)并獲得了iPSCs。由于hDPCs來(lái)源廣泛而易獲得、增殖能力強(qiáng)而易保存、由紫外線引起的基因突變幾率小，且具有良好的HLA配型等優(yōu)點(diǎn)，Tamaoki等提出可通過(guò)將hDPCs重編程而建立人iPSCs細(xì)胞庫(kù)應(yīng)用于臨床治療。

Yan等［17］報(bào)道，采用病毒載體將 Lin28/Nanog/Oct4/Sox2和 c－Myc/Klf4/Oct4/Sox2分別轉(zhuǎn)染人的牙髓干細(xì)胞、脫落乳牙干細(xì)胞、牙乳頭干細(xì)胞后，上述這些細(xì)胞均表現(xiàn)出與胚胎干細(xì)胞相似的表型，不僅表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物 SSEA－4、TRA －1－60、TRA－1－80、TRA－2－49、Nanog、Oct4 和Sox2;同時(shí)還能在體外分化為三胚層來(lái)源的細(xì)胞，并可在體內(nèi)形成畸胎瘤。Iida等［18］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染早期(第1～6天)的hDPCs在低氧(30 mL/L)條件下的重編程率是其常氧(210 mL/L)條件下的3.3 ～5.1倍。Yoo 等［19］報(bào)道，通過(guò)轉(zhuǎn)染 Oct4 和Sox2將hDPCs重編程為iPSCs(2F hDPC－iPSCs)后，可誘導(dǎo)其定向分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，并能促進(jìn)血管和肌肉的再生;與其他方法獲得的iPSCs相比，2F hDPC－iPSCs具有更高的血管向分化能力，有望應(yīng)用于缺血性血管疾病的治療。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓細(xì)胞來(lái)源的iPSCs比皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSCs更適合建立神經(jīng)精神病學(xué)研究模型。

一些學(xué)者認(rèn)為，牙髓中存在一種與ESCs或iPSCs相似的多能性干細(xì)胞，與ESCs和iPSCs相比其成瘤風(fēng)險(xiǎn)較小。Atari等［21］采用含生長(zhǎng)因子EGF、PDGF和LIF的培養(yǎng)基從人的第三恒磨牙牙髓中分離出了具有胚胎干細(xì)胞標(biāo)記的多潛能干細(xì)胞 (DPPSCs)，其不僅表達(dá) OCT3/4、NANOG和SOX2，同時(shí)還表達(dá)與 iPSCs相同的 SOX1、BDNF、MIXL1、GATA4和GATA6;并能在體外向三胚層細(xì)胞分化、在體內(nèi)形成畸胎瘤樣結(jié)構(gòu)。有學(xué)者認(rèn)為，雖然DPPSCs的比例會(huì)隨年齡而降低，但這個(gè)群體依然會(huì)永久存在于牙髓中。Liu 等［22－23］發(fā)現(xiàn)，牙髓細(xì)胞具有與iPSCs相同的多能干細(xì)胞表記物Oct4和Sox2的表達(dá)，隨著hDPCs體外傳代其表達(dá)水平在P2時(shí)達(dá)峰值后出現(xiàn)下降，而BMP－4則可維持至傳代后期，并在傳代后期的DPCs中仍有Oct－4、Sox2和Tert的表達(dá);體內(nèi)大鼠牙髓牙周聯(lián)合損傷4周時(shí)，可見Sox2、Oct－4和c－Myc在損傷處的新生牙髓組織和牙周韌帶組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。另有研究表明［24］，TNF－α短暫刺激能上調(diào)hDPCs的CD146、STRO－1、SSEA－4 蛋白和 OCT－4、NANOG mRNA的表達(dá)水平，并能促進(jìn)hDPCs的克隆形成、遷移和成牙本質(zhì)、成脂向分化，從而提高DPCs的胚胎干細(xì)胞特性。

Oct－4/Sox2復(fù)合體在細(xì)胞分化和重編程基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位，它們可通過(guò)共同作用而調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子(如 c－Myc，Klf4，F(xiàn)GF4和Nanog)的表達(dá)，并調(diào)控細(xì)胞的多能性［25－26］。將體細(xì)胞重編程為iPSCs時(shí)，一般需要其被迫的表達(dá)Oct4和Sox2(除非該細(xì)胞中有內(nèi)源性Sox2的表達(dá))［27］。目前，完全重編程一般需要4種基因同時(shí)組合轉(zhuǎn)染，而大量病毒載體整合的基因組所產(chǎn)生的iPSCs尚存在一定的不安全性和臨床應(yīng)用隱患。因此，尋找一個(gè)或兩個(gè)具備獨(dú)立啟動(dòng)重編程功能的核心因子已成為目前研究的主要目標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)，Oct－4和Sox2共同作用仍不足以使細(xì)胞獲得全能性，需要借助輔激活因子(coactivators)的作用［28］。輔因子一般在大多細(xì)胞中均有表達(dá)，但是胚胎干細(xì)胞對(duì)某些輔因子水平減少的反應(yīng)比體細(xì)胞敏感［27］。SCC/XPC 可通過(guò)與 Oct－4、Sox2 直接作用而調(diào)控下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、啟動(dòng)細(xì)胞重編程;并能有效提高細(xì)胞自我更新能力和重編程效率。由此推測(cè)，可通過(guò)SCC/XPC調(diào)節(jié)內(nèi)源性重編程因子的表達(dá)，激活和增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞特性基因的表達(dá)，并促使體細(xì)胞發(fā)生重編程，從而更安全有效的獲得iPSCs。

隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞組織工程的發(fā)展，再生醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要分支。干細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和核心，而人體iPSCs的產(chǎn)生則可使大量多能性人體干細(xì)胞的提供成為可能。雖然SCC/XPC可能是細(xì)胞重編程信號(hào)啟動(dòng)的必要元件，但其對(duì)牙源性細(xì)胞重編程及組織再生的調(diào)控作用尚不清楚。因此，揭示 SCC/XPC對(duì) Oct－4/Sox2復(fù)合體及其下游信號(hào)的調(diào)控作用機(jī)制有助于闡明牙再生的分子機(jī)制，并可為尋求促進(jìn)牙體組織修復(fù)的方法提供新思路。由此可見，通過(guò)SCC/XPC改變內(nèi)源性信號(hào)而優(yōu)化DPCs的性能和提高其干性，并使之作為種子細(xì)胞用于人體組織和器官的修復(fù)和重建，具有良好的應(yīng)用前景。

［1］Fong YW，Inouye C，Yamaguchi T，et al.A DNA repair complex functions as an Oct4/Sox2 coactivator in embryonic stem cells［J］.Cell，2011，147(1):120 －131.

［2］Masutani C，Sugasawa K，Yanagisawa J，et al.Purification and cloning of a nucleotide excision repair complex involving the xeroderma pigmentosum group C protein and a human homologue of yeast RAD23［J］.EMBO J，1994，13(8):1831 －1843.

［3］Sugasawa K.XPC:its product and biological roles［J］.Adv Exp Med Biol，2008，637:47 －56.

［4］Sugasawa K.Multiple DNA damage recognition factors involved in mammalian nucleotide excision repair［J］.Biochemistry(Moscow)，2011，76(1):16 －23.

［5］Lubin A，Zhang L，Chen H，et al.A Human XPC Protein Interactome－A Resource［J］.Int J Mol Sci，2014，15(1):141 －158.

［6］Raasi S，Orlov I，F(xiàn)leming KG，et al.Binding of polyubiquitin chains to ubiquitin－associated(UBA)domains of HHR23A［J］.J Mol Biol，2004，341(5):1367 －1379.

［7］Richly H，Rape M，Braun S，et al.A series of ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation and proteasomal targeting［J］.Cell，2005，120(1):73 －84.

［8］Bergink S，Theil AF，Toussaint W，et al.Erythropoietic defect associated with reduced cell proliferation in mice lacking the 26S proteasome shuttling factor rad23b［J］.Mol Cell Biol，2013，33(19):3879－3892.

［9］Sugasawa K.Regulation of damage recognition in mammalian global genomic nucleotide excision repair［J］.Mutat Res，2010，685(1－2):29－37.

［10］Nishi R，Okuda Y，Watanabe E，et al.Centrin 2 stimulates nucleotide excision repair by interacting with xeroderma pigmentosum group C protein［J］.Mol Cell Biol，2005，25(13)5664 －5674.

［11］Ito S，Yamane M，Ohtsuka S，et al.The C－terminal region of Xpc is dispensable for the transcriptional activity of Oct3/4 in mouse embryonic stem cells［J］.FEBS Lett，2014，588(7):1128－1135.

［12］Le May N，Mota－Fernandes D，Vélez－Cruz R，et al.NER factors are recruited to active promoters and facilitate chromatin modification for transcription in the absence of exogenous genotoxic attack［J］.Mol Cell，2010，38(1):54 －66.

［13］Krzeszinski JY，Choe V，Shao J，et al.XPC promotes MDM2－mediated degradation of the p53 tumor suppressor［J］.Mol Biol Cell，2014，25(2):213 －221.

［14］Jain AK，Allton K，Iacovino M，et al.p53 Regulates cell cycle and MicroRNAs to promote differentiation of human embryonic stem cells［J］.Plos Biol，2012，10(2):e1001268.

［15］Choi YJ，Lin C，Ho JJ，et al.miR－34 miRNAs provide a barrier for somatic cell reprogramming［J］.Nat Cell Biol，2011，13(11):1353－1360.

［16］Tamaoki N，Takahashi K，Tanaka T，et al.Dental pulp cells for induced pluripotent stem cell banking［J］.J Dent Res，2010，89(8):773－778.

［17］Yan X，Qin H，Qu C，et al.iPS Cells reprogrammed from human mesenchymal－like Stem/Progenitor cells of dental tissue origin［J］.Stem Cells Dev，2010，19(4):469 －480.

［18］Iida K，Takeda－Kawaguchi T，Hada M，et al.Hypoxia－enhanced derivation of iPSCs from human dental pulp cells［J］.J Dent Res，2013，92(10):905 －910.

［19］Yoo CH，Na H，Lee D，et al.Endothelial progenitor cells from human dental pulp－derived iPS cells as a therapeutic target for ischemic vascular diseases［J］.Biomaterials，2013，34(33):8149－8160.

［20］Chen J，Lin M，F(xiàn)oxe JJ，et al.Transcriptome comparison of human neurons generated using induced pluripotent stem cells derived from dental pulp and skin fibroblasts［J］.PLoS ONE，2013，8(10):e75682.

［21］Atari M，Gil－Recio C，F(xiàn)abregat M，et al.Dental pulp of the third molar:a new source of pluripotent－like stem cells［J］.J Cell Sci，2012，125(14):3343 －3356.

［22］Liu L，Wei X，Ling J，et al.Expression pattern of Oct－4，Sox2，and c－Myc in the primary culture of human dental pulp derived cells［J］.J Endod，2011，37(4):466 －472.

［23］Liu L，Wei X，Huang R，et al.Effect of bone morphogenetic protein－4 on the expression of Sox2，Oct－4，and c－Myc in human periodontal ligament cells during Long－term culture［J］.Stem Cells Dev，2013，22(11):1670 －1677.

［24］Ueda M，F(xiàn)ujisawa T，Ono M，et al.A short－term treatment with tumor necrosis factor－alpha enhances stem cell phenotype of human dental pulp cells［J］.Stem Cell Res Ther，2014，5(1):31.

［25］Babaie Y，Herwig R，Greber B，et al.Analysis of Oct4－Dependent transcriptional networks regulating Self－Renewal and pluripotency in human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2007，25(2):500 －510.

［26］Li J，Pan G，Cui K，et al.A dominant－negative form of mouse SOX2 induces trophectoderm differentiation and progressive polyploidy in mouse embryonic stem cells［J］.J Biol Chem，2007，282(27):19481 －19492.

［27］Young RA.Control of the embryonic stem cell state［J］.Cell，2011，144(6):940 －954.

［28］Wu Q，Bruce AW，Jedrusik A，et al.CARM1 is required in embryonic stem cells to maintain pluripotency and resist differentiation［J］.Stem Cells，2009，27(11):2637 － 2645.