β-櫻草糖苷酶對茶葉醇系香氣的影響研究進展

鄧慧莉，孫 云，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州350002)

茶葉以其獨特的香氣滋味而名聞天下。香氣是茶葉品質(zhì)的重要衡量指標，20 世紀50年代中期開始對茶葉香氣展開較為系統(tǒng)的研究［1－3］。由于技術(shù)與設(shè)備的限制，早期研究僅局限于茶葉香氣的提取方法及組分鑒定等。近年來，由于微量分析技術(shù)的快速發(fā)展，對茶葉加工和貯藏中的香氣變化、不同茶類和品種的香氣差異以及香氣形成機理等方面都展開了研究［4－7］。

茶葉香氣的合成途徑較為復雜，在已知的香氣形成途徑中，由糖苷類物質(zhì)水解生成相應的醇類物質(zhì)受到廣泛關(guān)注。國內(nèi)外研究表明［8－11］，β-櫻草糖苷是茶葉醇系香氣物質(zhì)的重要前體，β-櫻草糖苷酶水解β-櫻草糖苷的過程對茶葉醇系香氣的形成具有關(guān)鍵作用。本文綜述了β-櫻草糖苷酶對醇系香氣影響的研究進展，并展望了β-櫻草糖苷酶的應用前景，以期為β-櫻草糖苷酶的深入研究提供依據(jù)。

1 茶葉醇系香氣的形成

醇類化合物種類和相對含量在各茶類中均較高，其中橙花叔醇、植醇、芳樟醇及其氧化物、脫氫芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、雪松醇、異植醇是各茶類共有的香氣成分。各茶類主要特征香氣物質(zhì)不同，如紅茶香氣的萜烯醇類物質(zhì)主要有芳樟醇、香葉醇、橙花醇等。

茶葉中醇類化合物的形成與轉(zhuǎn)化有多條途徑，制茶發(fā)酵過程的酶促氧化作用引起一系列次生氧化與伴隨作用［12］。茶葉中包括游離態(tài)、結(jié)合態(tài)兩種醇系香氣，醇系香氣的主要來源是結(jié)合態(tài)香氣，包括萜烯醇類和芳樟醇類化合物，它們在茶鮮葉中基本以糖苷形式存在［13］。糖苷酶類能有效水解糖苷類香氣前體，并釋放出相應的醇系香氣。

1.1 糖苷類香氣前體

1.1.1 茶葉中的糖苷類香氣前體 糖苷類香氣前體是以與單糖或雙糖結(jié)合的配基形式存在。目前已有20 多種糖苷類香氣前體得到分離鑒定，大部分是二糖苷和單糖苷，其中以β-櫻草糖苷為主的二糖苷含量高于以β-葡萄糖苷為主的單糖苷［11，14，15］。Guo et al［16］首次從茶葉中分離得到香氣前體香葉基-β-櫻草糖苷。Moon et al［17］從茶葉中分離出順、反式芳樟醇氧化物和8-羥基牻牛兒基-β-櫻草糖苷。Yano et al［18］、Kobayashi et al［19］、Nishikitani et al［20］、Guo et al［21］、Sakata et al［22－23］、Ma et al［24］、張正竹等［25］利用柱層析法分離茶葉中的β-櫻草糖苷，發(fā)現(xiàn)主要苷元是順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物，并且結(jié)合在β-櫻草糖苷的苷元多于β-葡萄糖苷，說明β-櫻草糖苷是茶樹中更為重要的前體物質(zhì)。Wang et al［26］測定紅茶加工過程中β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的活性及釋香能力均比β-葡萄糖苷酶強。Yang et al［27］在綠茶加工過程中添加外源β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，研究酶對香氣釋放的影響，認為β-櫻草糖苷酶釋香能力比β-葡萄糖苷酶強，這與Wang et al［26］的研究結(jié)果一致。

1.1.2 茶葉加工中糖苷類香氣前體的變化 糖苷類香氣前體的含量與加工過程緊密聯(lián)系。Fischer et al［28］認為許多糖苷類香氣前體未被水解，有些鮮葉中并不存在的前體物質(zhì)在加工過程中逐漸形成，說明茶葉加工過程存在糖苷的合成反應。Wang et al［14］研究了紅茶加工中糖苷含量的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)鮮葉中櫻草糖苷的含量遠遠高于葡萄糖苷，成品茶中櫻草糖苷含量很低，而葡萄糖苷含量卻達到鮮葉含量的70%，說明β-櫻草糖苷是紅茶的主要香氣前體物質(zhì)。烏龍茶曬青過程中，很多糖苷類物質(zhì)含量上升，成品茶的糖苷達到最高值［26］。張正竹等［29］檢測綠茶加工中糖苷含量變化，認為成品綠茶保留鮮葉中77%的香氣前體物質(zhì)。

1.2 茶葉中的糖苷酶類

分布于茶葉細胞中的糖苷酶種類豐富，其中香氣形成的關(guān)鍵酶是β-櫻草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶［30］。

Sakata et al［31］通過純化茶鮮葉粗酶提取物，得到β-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶，首次證明茶葉中存在參與香氣釋放的β-葡萄糖苷酶。Guo et al［32］首次在茶葉中發(fā)現(xiàn)香氣前體β-櫻草糖苷。為了進一步探明香氣釋放相關(guān)內(nèi)源酶系，Ogawa et al［30］、Guo et al［33］、Ijima et al［34］層析純化茶鮮葉粗酶提取物，分別從不同鮮葉品種中得到了β-櫻草糖苷酶。

2 β-櫻草糖苷酶研究現(xiàn)狀

β-櫻草糖苷酶是水解香氣前體生成相應香氣成分的雙糖苷水解酶。已有研究表明［33，35］，β-櫻草糖苷酶對茶葉中醇系香氣的釋放至關(guān)重要。

2.1 β-櫻草糖苷酶活性

2.1.1 專一性 β-櫻草糖苷酶的專一性表現(xiàn)在對β-櫻草糖基部分的底物特異性。Guo et al［32］研究β-櫻草糖苷酶對不同底物的水解活性，發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶對(S)-芳樟醇-β-櫻草糖苷等具有較高的活性，說明其對底物具有相對專一性。Matsumura et al［15］進一步研究β-櫻草糖苷酶的專一性，以人工合成的櫻草糖苷、甾菜糖苷為材料證明β-櫻草糖苷酶對配糖體和糖基均具有嚴格特異性。Ijima et al［34］研究發(fā)現(xiàn)，β-櫻草糖苷酶的底物專一性是對含有1 －6 糖苷鍵的雙糖苷的相對專一性。Han et al［36］通過構(gòu)建β-櫻草糖苷酶3D 模型，發(fā)現(xiàn)僅β-櫻草糖苷可與其對接的結(jié)合位點，從分子動力學角度驗證了β-櫻草糖苷酶的基團專一性。

2.1.2 影響β-櫻草糖苷酶活性的因素 酶促反應速度受pH、溫度、酶濃度、激活劑、抑制劑等多種因素影響。Guo et al［21］從粗酶中精制分離出β-櫻草糖苷酶并研究其性質(zhì)，認為β-櫻草糖苷酶的相對分子質(zhì)量約為61 ku，最適溫度為45 －50 ℃，最適pH 為5 －7，穩(wěn)定溫度在45 ℃以下。

茶葉中糖苷酶活性還受到品種、生態(tài)環(huán)境、采摘方式、加工等因素的影響。新梢不同葉位間β-櫻草糖苷酶活性表現(xiàn)為:芽＞第1 葉＞第2 葉＞第3 葉＞莖梗。Ogawa et al［37］研究表明，嫩葉中的β-櫻草糖苷酶及其香氣前體含量很高，并隨著葉齡增加而降低。

2.2 β-櫻草糖苷酶分子生物學研究

早期對β-櫻草糖苷酶的研究集中于分離純化、加工中變化規(guī)律以及分析不同品種間的差異性等生理生化水平。近年來，相關(guān)研究已逐步向分子水平發(fā)展。費月［38］克隆茶樹β-櫻草糖苷酶基因，cDNA 全長為1729 bp，ORF 框為1524 bp，編碼507 個氨基酸，并將β-櫻草糖苷酶的ORF 框片段插入原核表達載體中，轉(zhuǎn)化至表達菌株，經(jīng)過誘導后表達出融合蛋白。趙麗萍等［39］利用熒光定量實時PCR 技術(shù)，檢測了龍井43 新梢的不同部位葉片中β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表達量，發(fā)現(xiàn)一芽一葉中β-櫻草糖苷酶基因表達量很低，一芽二葉最高，而后隨著葉齡增加而降低;β-葡萄糖苷酶的基因表達量遠遠高于β-櫻草糖苷酶。張廣輝［40］研究UV-B 處理對β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表達以及離體茶樹葉片香氣的影響，認為短時間UV-B 處理可以刺激糖苷類水解酶的基因活性，從而使更多香氣前體水解并釋放香氣。Shi et al［41］研究表明，經(jīng)過茉莉酸甲酯處理的龍井43 茶樹葉片中β-櫻草糖苷酶表達水平增加3 倍。

深入研究茶樹的基因表達，可以進一步揭示茶葉香氣形成的分子機理，利用人工手段促使糖苷酶類活性變化朝著提高茶葉品質(zhì)的方向發(fā)展，為研制香型獨特高長的優(yōu)質(zhì)茶葉產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)［42－46］。

2.3 β-櫻草糖苷酶對醇系香氣形成的影響

β-櫻草糖苷酶是糖苷類水解關(guān)鍵酶，能夠?qū)Ｒ恍运猞?櫻草糖苷，這與醇系香氣的形成緊密相關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的香氣前體后［32］，國內(nèi)外學者通過純化得到β-櫻草糖苷酶并對其性質(zhì)進行研究，從而進一步探明香氣釋放相關(guān)水源酶系［8，33，34］。Mizutani et al［47］研究發(fā)現(xiàn)，β-櫻草糖苷酶可能位于細胞壁上，而香氣前體在液泡中，當茶葉組織受到損傷或破壞時，酶觸碰不同香氣前體后釋放香氣。Sakata et al［22］在對烏龍茶醇系香氣形成機理的研究中，分離并鑒定出了香葉醇、芳樟醇及其氧化物Ⅰ和Ⅱ、2-苯乙醇、芐醇等主要醇類香氣前體，利用丙酮粉末、β-D-葡萄糖苷與柚苷酶分別與香葉醇－櫻草糖苷、(S)-芳樟醇—櫻草糖苷反應，發(fā)現(xiàn)丙酮粉末水解香葉醇—櫻草糖苷、(S)-芳樟醇－櫻草糖苷有較高的活性，說明除了β-葡萄糖苷酶，還有其他和茶葉醇系香氣形成相關(guān)的酶。進一步的試驗發(fā)現(xiàn)［22］，β-櫻草糖苷酶對櫻草糖苷的水解活性與丙酮粉末類似，而且香葉基-β-櫻草糖苷的水解率明顯高于香葉基-β-D-糖苷，表明β-櫻草糖苷酶是使茶葉醇系香氣得以釋放的主要酶。

3 問題與展望

在逐漸掌握β-櫻草糖苷酶酶學特性的過程中，對其底物β-櫻草糖苷的研究也獲得了相應成果。主要測定方法有對硝基苯酚法和甲基傘形酮法，由于底物獲得難度較大，目前暫時沒有明確測定β-櫻草糖苷酶活性的方法，研究結(jié)果難以進行比較分析。為了進一步研究不同環(huán)境中β-櫻草糖苷酶活和表達量的變化，尋找酶與香氣成分之間的相關(guān)性及獲得底物的方法也是研究的重點。從分子生物學角度研究β-櫻草糖苷酶有利于認識其分子本質(zhì)及表達調(diào)控機理，并運用于茶葉加工中。在對香氣品質(zhì)的調(diào)控中，通過外源添加β-櫻草糖苷酶不可調(diào)控的因素較多，通過分子生物學研究茶樹β-櫻草糖苷酶可以有效解決這個問題，也為選育優(yōu)質(zhì)茶樹品種奠定基礎(chǔ)。

茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)含量較為豐富并且難以得到標樣，要對其進行定性定量比較困難。通過酶解方法得到香氣物質(zhì)可以提高茶葉香氣品質(zhì)，如何充分利用這門技術(shù)釋香是今后研究的重點?；蚬こ碳夹g(shù)可以有效地克服糖苷酶在應用中的局限性，因此通過基因工程手段將為醇系香氣釋放提供技術(shù)保障。

進一步開展糖苷酶在茶樹栽培及加工過程中的變化、糖苷酶多樣性及作用機理等相關(guān)研究將更好地揭示茶葉香氣形成機理。而且，研究糖苷酶在茶葉加工過程中的變化規(guī)律可以豐富茶葉加工理論。另外，酶在細胞中的定位分析研究有待進一步深入，如何防止其他細胞組分的干擾，分離純化特定細胞器，有利于酶的研究。隨著對糖苷酶研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)其對茶葉深加工、食品、化工、制藥等多領(lǐng)域具有深遠的影響。利用糖苷酶提高茶飲料香氣，并改善茶飲料風味。糖苷酶處理的食品也具有獨特風味，預示著其在茶葉深加工和食品風味改良等方面有廣闊的應用前景。

［1］朱旗，施兆鵬，任春梅.談茶葉香氣制備與保存的幾個問題［J］.中國茶葉，2001(2):10 －11.

［2］李名君.茶葉香氣研究進展［J］.國外農(nóng)學——茶葉，1984(4):1 －15.

［3］李名君.茶葉香氣研究進展［J］.國外農(nóng)學——茶葉，1985(5):1 －8.

［4］何華鋒，朱宏凱，董春旺，等.黑茶香氣化學研究進展［J］.茶葉科學，2015(2):121 －129.

［5］張啟，羅龍新，程其春，等.茶香氣成分研究進展及護香的探討［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊)，2014(2):45 －47，50.

［6］張磊，楊如興，陳芝芝，等.不同茶類加工工藝對茗科1 號香氣成分的影響［J］. 福建農(nóng)業(yè)學報，2013，28(12):1257 －1262.

［7］宛曉春，李大祥，張正竹，等.茶葉生物化學研究進展［J］.茶葉科學，2015，35(1):1 －10.

［8］宛曉春.茶葉生物化學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003:119 －127.

［9］丁勇.茶葉中糖苷酶類的研究進展［J］.中國茶葉加工，2001(4):34 －36.

［10］YANG Z，BALDERMANN S，WATANABE N. Recent studies of the volatile compounds in tea［J］. Food Research International，2013，53(2):585 －599.

［11］WANG D M，YOSHIMUM T，KUBOTA K，et al. Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.1.Qualitative and quantitative analyses of glycosides with aglycons as aroma compounds［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(11):5411 －5418.

［12］蕭偉祥.制茶發(fā)酵的生化機制［J］.茶葉科學，1987，7(2):1 －6.

［13］WANG H F，YOU X Q. Free and glycosidically bound monoterpene alcohols in Qimen black tea［J］. Food Chemistry，1996，56(4):395 －398.

［14］WANG D M，KURASAWA E，YAMAGUCHI Y，et al. Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.2.changes in glycoside contents and glycosidase activities in tea leaves during the black tea manufacturing process［J］. Joumal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(4):1900 －1903.

［15］MATSUMURA S，TAKAHASHI S，NISHILKITANI M，et al. The role of diglycosides as tea aroma precursors:Synmesis of tea diglycosides and specificity of glycosidases in tea leaves［J］. Joumal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(7):2674 －2678.

［16］GUO W，SAKATA K，WATANABE N，et al. Geranyl-6-O-β-d-xylopyl-β-d-glucopyranoside isolated as all aroma precursor from tea leaves for oolong tea［J］. Phytochemistry，1993，33(6):1373 －1375.

［17］MOON J H，WATANABE，SAKATA K，et al. 38th Symposium on the chemistry of Terpenes，Essential oils and Aeomatics［J］. Nilgata，1994，45(3):63 －65.

［18］YANO M，JOKI Y，MUTOH H，et al. Benzyl glucoside from tea leaves［J］. Agric Biol Chem，1991，55(4):1205－1206.

［19］KOBAYASHI A，KUBOTA K，JOKI Y，et al. (Z)-3-hexenyl-β-D-glucopyranoside in fresh tea leaves as a precursor of green odor［J］. Biosci Biotech Biochem，1994，58(3):592 －593.

［20］NISHIKITANI M，KUBOTA K，KOBAYASHI A，et al. Geranyl 6-O-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside isolated as an aroma precursor from leaves of a green tea cultivar［J］. Biosci Biotech Biochem，1996，60(8):929 －931.

［21］GUO W，SASAKI N，F(xiàn)UKUDA M，et al. Isolation of an aroma precursor of benzyldehyde from tea leaves (Camellia sinensis var.sinensis cv.Yabukita)［J］. Biosci Biotech Biochem，1998，62(10):2052 －2054.

［22］SAKATA K，GUO W，MOON J H. Tea chemistry part Ⅱ:With special reference to tea aroma precursors［M］. New Delhi:Aravali Books Internationa，1999:692 －704.

［23］SAKATA K. β-primeverosidase relationship with floral tea aroma formation during processing of oolong tea and black tea［M］.Washington:American Chemical Society，2000:327 －335.

［24］MA S J，WATANABE N，YAGI A，et al. The (3R，9R)-3-hydroxy-7，8-dihydro-β-ionol disaccharide glycoside is an aroma precursor in tea leaves［J］. Phytochemistry，2001，56:819 －825.

［25］張正竹，宛曉春，陶冠軍.茶鮮葉中糖苷類香氣前體的液質(zhì)聯(lián)用分析［J］.茶葉科學，2005，25(4):275 －281.

［26］WANG D，KUBOTA K，KOBAYASHI A，et al. Analysis of glycosidically bound aroma precursors in tea leaves.3.Change in the glycoside content of tea leaves during the oolong tea manufacturing process［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49:5391 －5396.

［27］YANG Z，KINOSHITA T，TANIDA A，et al. Analysis of coumarin and its glycosidically bound precursor in Japanese green tea having sweet-herbaceous odour［J］. Food Chemistry，2009，114:289 －294.

［28］FISCHER N，NITZ S，DRAWERT E. Bound flavour compounds in plants:Free and bound flavour compounds in green and black tea［J］. Z Lebensm Unters Forsch，1987，185:195 －201.

［29］張正竹，宛曉春.鮮葉攤放過程中呼吸速率、葡萄糖苷酶活性、游離態(tài)香氣和糖苷類香氣前體含量的變化［J］.植物生理學通訊，2003，39(2):134 －136.

［30］OGAWA K，IJIMA Y，GUO W F，et al. Purification of a β-primeverosidase concerned with alcoholic aroma formation in tea leaves (cv.Shuixian)to be processed to oolong tea［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(3):877－882.

［31］SAKATA K，GUO W，MOON J，et al. On plant growth and enviroment suwankorea［J］. Proc Symp，1993，36(2):72 －83.

［32］GUO W，HOSOI R，SAKATA K，et al. (S)-linalyl，2-phenylethyl，and benzyl disaccharde glycosides isolated as aroma precursors from oolong tea leaves［J］. Bioscience，Biotechnology，Biochemistry，1994，58(8):1532 －1534.

［33］GUO W，YAMAUCHI K，WATANABE N，et al. A primeverosidase as a main glycosidase concerned with me alcoholic aroma fomation in tea leaves［J］. Bioscience，Biotechnology，Biochemistry，1995，59(5):962 －964.

［34］IJIMA Y，OGAWA K，WATANABE N，et al. Characterization of β-primeverosidase，being concerned with alcoholic aroma formation in tea leaves to be processed into black tea，and preliminary observations on its substrate specificity［J］. J Agric Food Chem，1998(46):1712 －1718.

［35］TAKEO T. Production of linalool and geraniol by hydrolytic breakdown of bound forms in disrupted tea shoots［J］. Phytochemistry，1981，120(9):2145 －2147.

［36］HAN W W，LI Z S，ZHENG Q C，et al. Toward a blueprint for β-primeverosidase from tea leaves structure/function properties:homology modeling study［J］. Journal of the Oretical and Computational Chemistry，2006(1):433 －446.

［37］OGAWA，MOON J，GUO W. A study on tea aroma formation mechanism:alcoholic aroma precursor amounts and glucosidase activity in parts of the tea plant［J］. Z Naturforsch C，1995，50:493 －498.

［38］費月.與茶葉香氣形成相關(guān)的三個內(nèi)源糖苷酶基因的克隆和原核表達［D］.合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學，2012.

［39］趙麗萍，陳亮，王新超，等.茶樹新梢不同葉片中β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶基因表達的實時定量PCR 分析［J］.茶葉科學，2006，26(1):11 －16.

［40］張廣輝.茶樹遺傳轉(zhuǎn)化及UV-B 對香氣相關(guān)基因表達影響的研究［D］.杭州:浙江大學，2007.

［41］SHI J，WANG L，MA C Y，et al. Aroma changes of black tea prepared from methyl jasmonate treated tea plants［J］. Journal of Zhejiang University Science，2014，15(4):313 －321.

［42］郭雯飛，孟小環(huán)，羅永此，等.白牡丹與白毫銀針香氣成分的研究［J］.茶葉，2007，33(2):78 －81.

［43］孫慶磊，梁月榮，陸建良，等.超聲波在茶葉提取中的應用［J］.茶葉，2006，32(2):79 －82.

［44］梁靖，須海榮.溫度對茶葉香氣的影響［J］.茶葉，2002，28(4):194 －196.

［45］孫其富，梁月榮.茶飲料香氣研究進展和增香技術(shù)探討［J］.茶葉，2003，29(4):198 －201.

［46］楊勇，楊賢強.湯記高山茶和平地茶品質(zhì)的對比研究［J］.茶葉，2004，30(2):91 －92，97.

［47］MIZUTANI M，NAKAILISHI H，EMA J，et al. Cloning of β-primeverosidase from tea leaves，a key enzyme in tea aroma formation［J］. Plant Physiology，2002，130(4):2164 －2176.