大棗多糖對(duì)慢性疲勞綜合癥大鼠的作用效果

邵長(zhǎng)專，唐 剛

（上海海事大學(xué)體育部，上海 201306）

大棗多糖對(duì)慢性疲勞綜合癥大鼠的作用效果

邵長(zhǎng)專，唐 剛

（上海海事大學(xué)體育部，上海 201306）

目的：揭示大棗多糖（jujube polysaccharide，JP）對(duì)慢性疲勞綜合癥（chronic fatigue syndrome，CFS）的預(yù)防作用。方法：采用水提醇沉法對(duì)JP進(jìn)行制備，同時(shí)建立大鼠CFS模型，通過(guò)服用不同劑量的JP，對(duì)大鼠的行為學(xué)方面進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，丙二醛（malonaldehyde，MDA）水平以及脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果：J P能夠顯著提高脾臟指數(shù)，降低血清MDA含量，改善T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。結(jié)論：JP對(duì)于CFS的預(yù)防效果與其調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力及改善抗氧化能力有關(guān)。

大棗多糖；慢性疲勞；免疫；抗氧化

慢性疲勞綜合癥（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種伴隨多種癥狀的綜合性病癥[1]，多由于身體疲勞與心理疲勞的積累而致病。CFS患者往往伴隨免疫力低下[2]及抗氧化能力下降[3]的現(xiàn)象。CFS患者除了應(yīng)當(dāng)針對(duì)性地進(jìn)行自身生活習(xí)慣的調(diào)整之外，還可以選擇中藥調(diào)養(yǎng)，目前已有研究人員證實(shí)中藥調(diào)養(yǎng)是治療CFS的重要手段[4]。大棗是常用于治療CFS的中藥材之一[5-6]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)大棗多糖（jujube polysaccharide，JP）能夠刺激免疫功能，提高抗氧化活性[7]，提示JP可能是作為治療CFS的主要活性成分之一。為了證實(shí)這一點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水提醇沉法制備JP，同時(shí)建立大鼠CFS模型，通過(guò)給大鼠灌胃JP檢測(cè)其作用效果，以揭示JP與CFS的關(guān)系以及治療功效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，6～8 周，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。

大棗購(gòu)自山東臨沂農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，粉碎后備用。

三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 北京化學(xué)試劑公司；二甲基亞砜、RPMI-1640培養(yǎng)基、刀豆素（s word bean，ConA）、Hank’s液、噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、透析袋（MW10 000） 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxid ase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物制劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752B型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Christ Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Tensor27紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 JP的制備

JP的制備過(guò)程如圖1所示，每1 000 g大棗提取獲得29.82 g粗JP，提取率為2.98%。

圖1 JP的提取過(guò)程Fig.1 Flowchart of JP extraction

1.3.2 JP成分測(cè)定

多糖含量測(cè)定：采用蒽酮-硫酸法[8]；糖醛酸含量測(cè)定：采用硫酸-咔唑法[9]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用雙縮脲法[10]。紅外光譜采集：稱取JP 3 mg，與適量干燥的溴化鉀（KBr）混勻，在瑪瑙研缽中研磨壓片，在紅外光譜儀上測(cè)定4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜。

1.3.3 CFS模型建立

將大鼠隨機(jī)分為5 組（每組10 只）：空白組，CFS對(duì)照組，JP低（100 mg/（kg?d））、中（200 mg/（kg?d））、高（400 mg/（kg?d））劑量組。參照文獻(xiàn)[11-12]采用電擊法、限制法和冷水游泳法誘導(dǎo)CFS對(duì)照組，JP低、中、高劑量組4 組大鼠形成CFS癥狀。4 周建模期，每周周日休息。操作細(xì)節(jié)如下：電擊法：在大鼠飼養(yǎng)籠下方中間放置用銅絲纏繞成排狀的電路板（20 cm×30 cm），每天兩次喂食的期間通電，大鼠要去覓食和飲水就必須踩踏通電銅絲后才能到達(dá)放置食物的另一端。限制法：將大鼠放置在一根自制的聚氯乙烯管（長(zhǎng)20.0 cm，直徑5.0 cm）中，頭部一側(cè)封閉并留有呼吸用的小洞，尾部一側(cè)用膠帶封閉，每隔一天進(jìn)行一次，每次2 h。冷水游泳法：將大鼠放置在21 ℃的水中游泳，每天1 次，每次30 min。4 周的建模期間，每天上午給JP各劑量組大鼠灌胃相應(yīng)劑量的JP水溶液，空白組和CFS對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.4 血清抗氧化指標(biāo)與免疫器官指數(shù)的測(cè)定

4 周造模期結(jié)束后，立刻對(duì)大鼠麻醉采血，少量血液制備血清，使用試劑盒測(cè)定血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量。大鼠處死后，立刻取脾臟和胸腺組織，按照下式計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.3.5 脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力測(cè)定

將脾臟置于預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)基中，洗滌后剪碎，針?biāo)┭心?，?jīng)200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，分離脾臟淋巴細(xì)胞，Hank’s液洗滌若干次，1 000 r/min離心10 min，取上清液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞需多于95%，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，置于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，平行2 孔，一孔加入50 μL ConA，另一孔作為對(duì)照。置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)終止前4 h，每孔吸出上清液0.7 mL，加入0.7 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入5 mg/mL MTT溶液50 μL，振蕩混勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，每孔加入1 mL酸性異丙醇，振蕩?kù)o置，1 500 r/min離心5 min取上清液，測(cè)定光密度值OD570nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 JP的組成分析

經(jīng)檢測(cè)，JP多糖含量為61.16%，糖醛酸含量為8.27%，蛋白質(zhì)含量為12.49%。紅外光譜圖（圖2）顯示：JP為典型的多糖結(jié)構(gòu)，在894.32、840.21 cm－1波數(shù)處的弱吸收峰表明其含有少量α-D-吡喃糖和β-D-吡喃糖。

圖2 JP的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of JP

2.2 免疫器官指數(shù)測(cè)定結(jié)果

免疫器官指數(shù)在一定程度上反映機(jī)體免疫狀況。由表1可知，與空白組相比，CFS對(duì)照組大鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)顯著下降，表明CFS模型對(duì)大鼠造成影響，使得大鼠免疫器官指數(shù)降低，進(jìn)而影響機(jī)體免疫能力。補(bǔ)充JP后，只有JP中、高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)較CFS對(duì)照組顯著增加，而對(duì)胸腺指數(shù)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠免疫器官指數(shù)對(duì)比 (x ±s, , n = 8)Table 1 Comparison of spleen index and thymus index in rats from different groups (x ±s, , n = 8)

2.3 脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 大鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (x ±s, , n = 8)Table 2 Effect of JP on T lymohocyte transformation (x ±s, , n = 8)

由表2可知，與空白組相比，CFS對(duì)照組大鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測(cè)定的OD570nm值顯著下降，表明CFS模型對(duì)大鼠的淋巴細(xì)胞活性造成影響。補(bǔ)充JP后，只有JP高劑量組大鼠的OD570nm值較CFS對(duì)照組顯著增加，且與空白組相比無(wú)顯著差異。

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量

表3 JP對(duì)大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響 (x ±s, , n = 8)Table 3 Effects of JP on the antioxidant status of CFS rats (x ±s, , n = 8)

由表3可知，與空白組相比，CFS對(duì)照組大鼠血清SOD、GSH-Px活性變化不明顯，但MDA含量極顯著性升高（P＜0.01）；補(bǔ)充JP后，大鼠血清SOD、GSH-Px活性與CFS對(duì)照組和空白組相比，變化都無(wú)顯著差異，只有JP高劑量組大鼠的MDA含量比CFS對(duì)照組顯著降低。

3 結(jié)論與討論

在大棗多糖提取的過(guò)程中，雖然對(duì)游離蛋白質(zhì)進(jìn)行了去除，但用雙縮脲法依然檢測(cè)到其含有蛋白質(zhì)，說(shuō)明大棗多糖是一種蛋白多糖。紅外光譜檢測(cè)的結(jié)果顯示JP屬于典型的多糖結(jié)構(gòu)，并含有少量α-D-吡喃糖和β-D-吡喃糖。

CFS是人體由于長(zhǎng)期處于身體與精神雙重壓力下而導(dǎo)致身體出現(xiàn)多種癥狀的一種疾病。為了更好地研究篩選CFS的治療藥物及作用效果，一般采用如精神刺激、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)、藥物以及限制活動(dòng)等方式建立CFS動(dòng)物模型[12-14]，造模時(shí)間不少于2 周[15]。本實(shí)驗(yàn)采用電擊法、限制法和冷水游泳法3 種方式建立CFS模型，為期4 周。有研究報(bào)道CFS患者一般會(huì)伴隨免疫能力低下及機(jī)體抗氧化能力下降的現(xiàn)象，如自然殺傷細(xì)胞活性降低、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力降低、脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加等[16-19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度、血清抗氧化酶活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量等指標(biāo)，結(jié)果顯示CFS對(duì)照組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度顯著降低，血液脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，說(shuō)明CFS模型建立較為成功，酶活性、部分免疫學(xué)指標(biāo)和氧化損傷指標(biāo)符合CFS患者的一般特征。

許多植物多糖能夠提高機(jī)體免疫能力[20-22]，一些研究認(rèn)為多糖提高免疫能力與其提供給免疫細(xì)胞能量有關(guān)[23]，而關(guān)于抗氧化方面的研究報(bào)道則認(rèn)為多糖本身具有一定的抗氧化功能[24-26]。大棗是傳統(tǒng)中藥治療CFS的常用藥材，大棗多糖可能是其中的主要活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的大棗多糖對(duì)CFS模型大鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度、血液脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物含量等指標(biāo)都有一定程度的改善作用，這可能與其免疫調(diào)節(jié)活性及抗氧化性有關(guān)，這也正是大棗治療CFS的機(jī)理之一。

[1] MEEUS M, van EUPEN I, van BARLE E, et al. Symptom fl uctuations and daily physical ain patients with chronic fatigue syndrome: a casecontrol study[J]. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, 2011, 92(11): 1820-1826.

[2] PRINSEN H, de VRIES I J, TORENSMA R, et al. Humoral and cellular immune responses after infl uenza vaccination in patients with chronic fatigue syndrome[J]. Biology Medicine Central Immunology, 2012, 13: 71. doi: 10.1186/1471-2172-13-71.

[3] GUPTA A, VIJ G, CHOPRA K. Possible role of oxidative stress and immunological activation in mouse model of chronical fatigue syndrome and its attenuation by olive extract[J]. Journal of Neuroimmunology, 2010, 226(1/2): 3-7.

[4] LIU Ya, ZHANG Haigang, LI Xiaohui. A Chinese herbal decoction, Danggui Buxue Tang, improves chronic fatigue syndrome induced by food restriction and forced swimming in rats[J]. Phytotherapy Research, 2011, 25(12): 1825-1832.

[5] CHEN Rui, MORIYA J, YAMAKAWA J, et al. Traditional Chinese medicine for chronic fatigue syndrome[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2010, 7(1): 3-10.

[6] WANG Bini, LIU Haifeng, ZHENG Jianbin, et al. Distribution of phenolic acids in different tissues of jujube and their antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(4): 1288-1292.

[7] WANG Bing. Chemical characterization and Ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48(3): 386-391.

[8] 劉曉涵, 陳永剛, 林勵(lì), 等. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測(cè)定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 270-272.

[9] TIAN Lingmin, ZHAO Yan, GUO Chao, et al. A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(2): 537-544.

[10] 王衛(wèi)國(guó), 吳強(qiáng), 胡寶坤, 等. 幾種測(cè)定灰樹花多糖中蛋白質(zhì)含量方法的比較研究[J]. 中國(guó)食用菌, 2002, 22(1): 27-30.

[11] LALREMRUTA V, PRASANNA G S. Evaluation of protective effect of Aegle marmelos Corr. in an animal model of chronic fatigue syndrome[J]. Indian Journal of Physiology and Pharmacology, 2012, 44(3): 351-356.

[12] ZOU Jun, YUAN Jianqi, Lü Shuang, et al. Effects of exercise on behavior and peripheral blood lymphocyte apoptosis in a rat model of chronic fatigue syndromn[J]. Journal of Huazhong University of Science and Technology: Medical Sciences, 2010, 30(2): 258-264.

[13] SHEVCHUK N A. Possible use of repeated cold stress for reducing fatigue in chronic fatigue syndrome: a hypothesis[J]. Behavioral and Brain Functions, 2007, 3: 55. doi: 10.1186/1744-9081-3-55.

[14] LYLE N, GOMES A, SUR T, et al. The role of antioxidant properties of Nardostachys jatamansi in alleviation of the symptoms of the chronic fatigue syndrome[J]. Behavioural Brain Research, 2009, 202(2): 285-290.

[15] SINGH A, NAIDU P S, GUPTA S, et al. Effect of natural and synthetic antioxidants in a mouse model of chronic fatigue syndrome[J]. Journal of Medicinal Food, 2002, 5(4): 211-220.

[16] CHEN Rui, MORIYA J, LUO Xianwen, et al. Hochu-ekki-to combined with interferon-gamma moderately enhances daily activity of chronic fatigue syndrome mice by increasing NK cell activity, but not neuroprotection[J]. Immunopharmacology Immunotoxicology, 2009, 31(2): 238-245.

[17] MAES M, KUBERA M, UYTTERHOEVEN M, et al. Increased plasma peroxides as a marker of oxidative stress in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome (ME/CFS)[J]. Medical Science Monitor, 2011, 17(4): 11-15.

[18] MARSHALL-GRADISNIL S, GOTTSCHALK G, RAMOS S, et al. The role of cytokines in the cerebrospinal fl uids of patients with chronic fatigue syndrome/myalgic encephalomyelitis (CFS/ME)[J]. Cytokine, 2014, 70(1): 31.

[19] BANSAL A S, BRADLEY A S, BISHOP K N, et al. Chronic fatigue syndrome, the immune system and viral infection[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2012, 26(1): 24-31.

[20] YUAN Chengfu, WANG Changdong, BU Youquan, et al. Antioxidative and immunoprotective effects of Pyracantha fortuneana (Maxim.) Li polysaccharides in mice[J]. Immunology Letters, 2010, 133(1): 14-18.

[21] ZHANG Yongbing, YANG Shifa, ZHAO Xue, et al. Immune enhancement of Taishan Robinia pseudoacacia polysaccharide on recombinant Proteus mirabilis OmpA in chickens[J]. International Immunopharmacology, 2014, 22(1): 236-241.

[22] WANG Nan, YANG Jingyue, LU Jianguo, et al. A polysaccharide from Salvia miltiorrhiza Bunge improves immune function in gastric cancer rats[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 111: 47-55.

[23] MITCHELL J B, PIZZA F X, PAQUET A, et al. Influence of carbohydrate status on immune responses before and after endurance exercise[J]. Journal of Applied Physiology, 1998, 84(6): 1917-1925.

[24] 孫曦曉, 劉再枝, 杜新琦, 等. 超聲輔助提取杜仲多糖及其抗氧化活性[J]. 植物研究, 2014, 34(3): 428-432.

[25] SUN Liqin, WANG Ling, LI Jing, et al. Characterization and antioxidant activities of degraded polysaccharides from two marine Chrysophyta[J]. Food Chemistry, 2014, 160: 1-7.

[26] PAN Saikun, WU Shengjun. Cellulase-assisted extraction and antioxidant activity of the polysaccharides from garlic[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 111: 606-609.

Preventive Effect of Jujube Polysaccharide on Chronic Fatigue Syndrome in Rats

SHAO Changzhuan, TANG Gang
(Department of Sport, Shanghai Maritime University, Shanghai 201306, China)

Objective: To reveal the preventive effect of jujube polysaccharides (JP) on chronic fatigue syndrome (CFS). Methods: JP were prepared from jujube fruits by water extraction and ethanol precipitation and their physicochemical properties were determined. A four-week old rat CFS model was established. The rats were orally administrated with JP and the b ehavior experiments were conducted after induction of CFS. The activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and the levels of malondialdehyde (MDA) in rat serum were eassayed. Spleen index, thymus index and T lymohocyte transformation were analyzed. Results: JP markedly decreased MDA levels in serum, and increased spleen index and T lymohocyte transformation. Conclusions: The preventive effects of JP on CFS are closely related to their immune-regulating function and antioxidant activity.

jujube polysaccharide; chronic fatigue; immune; antioxidant

G804.7

A

1002-6630（2015）01-0205-04

10.7506/spkx1002-6630-201501039

2014-07-01

教育部博士點(diǎn)基金聯(lián)合資助項(xiàng)目（20123121120004）；上海海事大學(xué)科研基金項(xiàng)目（20130474）

邵長(zhǎng)專（1971—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)轶w育教育與健康。E-mail：scz1971@126.com