菰黑粉菌分離方法的研究

曹乾超，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州，310018）

茭白（Zizania latifolia）為禾木科菰屬多年生宿根草本植物，廣泛種植于太湖一帶的江蘇、浙江兩省[1]。作為我國(guó)僅次于蓮藕的第二大水生蔬菜，茭白具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。分析表明，茭白膨大的肉質(zhì)莖內(nèi)含有較多蛋白質(zhì)、膳食纖維及鉀、鈉、鎂等元素[2]。除此之外，茭白還含有一些藥用成分，對(duì)高血壓、心臟病等的防治大有裨益[3]。茭白孕茭是茭白植株與專一性寄生在其體內(nèi)的菰黑粉菌（Ustilago esculenta）共同作用的結(jié)果。形成的可食用肉質(zhì)莖為正常茭，另有肉質(zhì)莖內(nèi)布滿褐色孢子堆為灰茭[3，4]。研究表明，寄生于正常茭和灰茭的菰黑粉菌屬于兩種不同類型，其中與正常茭白共生的菰黑粉菌為MT（mycelia-teliospore）型，多以菌絲形態(tài)存在；而侵染灰茭的菰黑粉菌為T（teliospore）型[3]，其菌絲潛育期較短。由于灰茭中布滿菰黑粉菌孢子堆，故分離灰茭中的菰黑粉菌方法比較成熟，常通過挑取菰黑粉菌孢子堆并稀釋涂布的方法[5～7]進(jìn)行分離培養(yǎng)。而正常茭白中菰黑粉菌多以菌絲態(tài)存在，分離較為困難，目前尚未有詳細(xì)的分離方法報(bào)道。

菰黑粉菌的分離是研究菰黑粉菌種群與茭白品種表型相關(guān)性以及茭白孕茭機(jī)制的基礎(chǔ)，因此建立標(biāo)準(zhǔn)、快速、有效的菰黑粉菌分離方式具有重要意義。本研究分別采用切片、研磨兩種方法從正常茭白中分離得到菰黑粉菌，通過擴(kuò)增其ITS-5.8S rDNA序列進(jìn)行鑒定，并對(duì)2種分離方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，2種方法均能分離得到菰黑粉菌，但是對(duì)于新鮮組織，研磨法分離效率較高，而對(duì)于放置較久的樣品，切片方法可以更好地控制雜菌污染，所以可以根據(jù)茭白組織的新鮮程度選擇合適的分離方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以浙江茭白品種龍茭2號(hào)正常茭為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑

Taq 酶、dNTP、10×PCR buffer、pMD19-T Vector、solutionⅠ購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，真菌DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、羧芐青霉素、卡那青霉素均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 培養(yǎng)基

YEPS雙抗固體培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，蔗糖20 g，加蒸餾水溶解后定容至1 000 mL，分裝，每100 mL液體培養(yǎng)基中加入1.5 g瓊脂，高壓滅菌，使用過程中加入羧芐青霉素和卡那霉素至終濃度為100 ng/mL。

1.4 試驗(yàn)方法

①菰黑粉菌的分離 剝掉新鮮茭白肉質(zhì)莖外包裹的葉鞘，流水沖洗，再用蒸餾水沖洗，晾干。在超凈工作臺(tái)上，按無菌操作方法進(jìn)行以下操作：先在無菌濾紙上將茭白切成適宜大小，用75%乙醇浸泡30 s，再放入無菌水中洗滌30 s，用無菌濾紙吸干水分，切去外皮，保留白嫩部分。

a.切片分離法將白嫩組織切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的薄片，貼在YEPS雙抗培養(yǎng)基上，每皿貼8～10片，用封口膜將培養(yǎng)皿密封，先正置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 h后倒置培養(yǎng)。

b.研磨分離法將白嫩組織切成薄片，取4～5片置于滅菌研缽中，加入1 mL滅菌水，將組織研碎，吸取200 μL汁液均勻涂布于YEPS雙抗培養(yǎng)基上，用封口膜將培養(yǎng)皿密封，倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

②形態(tài)鑒定 待YEPS雙抗培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌株后，肉眼觀察菌落形態(tài)，同時(shí)用牙簽挑取菌落置于無菌水中，取10 μL菌液置光學(xué)顯微鏡下觀察。

③分子鑒定 a.基因組DNA的提取。挑取純培養(yǎng)物在YEPS固體培養(yǎng)基上劃線，3 d后，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

b.ITS-5.8S rDNA序列的PCR擴(kuò)增。應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增兩種方法分離得到菌株的ITS-5.8S rDNA，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Primer ITS1 1 μL，Primer ITS4 1 μL，template 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ forever。

c.瓊脂糖凝膠電泳。向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量6×loading buffer，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀察并拍照。

d.TA克隆及序列分析。將目的條帶割膠回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，連接體系為：回收產(chǎn)物 4.5 μL，solutionⅠ5 μL，pMD19-T 0.5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α，37℃培養(yǎng) 12～14 h后，挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。將含有目的基因的菌液送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表1 引物ITS1和ITS4的序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 菰黑粉菌的分離及形態(tài)特征

①切片分離法 在YEPS雙抗培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5 d后茭白組織開始呈現(xiàn)褐色，7～9 d后，茭白切片與平板接觸面處長(zhǎng)出淡黃色的菌落（圖1）。

②研磨分離法 在YEPS雙抗培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，肉眼即可觀察到微小的菌落形成，培養(yǎng)7～9 d后長(zhǎng)出淡黃色菌落伴有向四周延伸的白色菌絲（圖1）。

挑取菌落至新的YEPS雙抗培養(yǎng)基上，28℃純化培養(yǎng)，2～3 d后長(zhǎng)出淡黃色菌落，4 d后菌落周圍長(zhǎng)出白色菌絲（圖2A），顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌存在2種形態(tài)：一種為酵母型，短桿狀，芽殖；一種為菌絲型，中間部分呈透明狀（圖2B）。

圖1 切片、研磨法分離菰黑粉菌示意

圖2 菰黑粉菌形態(tài)觀察

2.2 菰黑粉菌的分子鑒定

將用切片法和研磨法分離得到的菌株提取DNA，對(duì)其ITS-5.8S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增克隆并測(cè)序，擴(kuò)增片段大小均在750 bp左右，結(jié)果見圖3。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，與菰黑粉菌（序列號(hào)：AB211915.1）的相似度為96%，具有較高同源性，可認(rèn)定為菰黑粉菌。新鮮程度，根據(jù)不同的樣品選擇合適的方法。

茭白的產(chǎn)生與菰黑粉菌的侵染密切相關(guān)，因此對(duì)菰黑粉菌的研究將有利于明確茭白的孕茭機(jī)理及灰茭的形成機(jī)制。在分離得到菰黑粉菌的基礎(chǔ)上，后續(xù)能夠有效地針對(duì)菰黑粉菌展開相關(guān)試驗(yàn)，從而揭示菰黑粉菌的種群特點(diǎn)及其在茭白植株中的作用機(jī)制。

圖3 菰黑粉菌ITS-5.8S rDNA序列擴(kuò)增

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的真菌鑒定主要從真菌的孢子形態(tài)、菌落特征、生理生化特征等方面進(jìn)行，而真菌種類繁多，這些早已無法滿足真菌分類鑒定的需求。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基于rDNA-ITS多態(tài)性的序列分析成為真菌分類及鑒定研究的熱點(diǎn)[8，9]。由于真菌通用引物ITS1和ITS4既能擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2，又能擴(kuò)增其間高度保守的5.8S rDNA，廣泛應(yīng)用于真菌的分子鑒定。

植物內(nèi)生真菌的分離方法有很多，針對(duì)不同的內(nèi)生真菌各有不同[10]。目前對(duì)菰黑粉菌的研究剛剛起步，其分離方法尚不成熟。本研究采用切片、研磨2種方法從新鮮的正常茭中分離菰黑粉菌，經(jīng)形態(tài)及分子生物學(xué)方法鑒定為菰黑粉菌。試驗(yàn)過程中應(yīng)當(dāng)注意，正常茭白組織最好是新鮮的。另外，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮的茭白組織通過研磨更容易分離出菰黑粉菌；若茭白組織長(zhǎng)時(shí)間放置，茭白表面容易孳生霉菌，研磨分離容易污染，而切片分離法則能夠較好的分離。因此，在試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)注意試驗(yàn)樣品

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