IGF-1及其受體對小鼠皮膚作用的研究

文│王恭遠 劉寧 程笳琪 赫曉燕（山西農業(yè)大學動物科技學院）

尚淑芬 武鋒平（山西省忻州市畜牧獸醫(yī)局）

IGF-1及其受體對小鼠皮膚作用的研究

文│王恭遠 劉寧 程笳琪 赫曉燕（山西農業(yè)大學動物科技學院）

尚淑芬 武鋒平（山西省忻州市畜牧獸醫(yī)局）

動物被毛的生長是一個極其復雜的生理過程，受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和代謝水平等諸多因素的影響，遺傳是被毛生長發(fā)育的決定性因素。小鼠是最常用的試驗動物之一，具有多色性、雜食性、適應性差、繁殖力強等特點。

IGF-1也被稱作“促生長因子”（somatomedin C），是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽蛋白物質。1976年Rinderknecht等將人血漿中的兩種不同的類胰島素生長因子分離純化出來，并于1978年成功鑒定出它們的化學結構組成和特性。由于它們的化學結構組成與胰島素原十分相似，所以又將它們命名為“IGF-1（胰島素樣生長因子-1）和IGF-2（胰島素樣生長因子-2）”。目前，有關毛囊周期性變化的調控機理并不十分明確，但已明確一些細胞因子參與了毛發(fā)的周期性調控，包括類胰島素生長因子（IGF）。IGF-1是類胰島素生長因子家族中的主要成員。研究表明，IGF-1對毛發(fā)的生長發(fā)育和周期起到一定調控作用。同時還能刺激黑色素細胞、上皮細胞和毛乳頭細胞等的增殖分化。

IGF-1與其受體（IGF-1R）結合，通過其受體間的細胞信號途徑來刺激毛囊細胞增殖。IGF-1可能通過其受體的細胞信號通路刺激毛囊細胞增殖。有報道稱在山羊局部皮膚注射IGF-1能夠刺激皮膚蛋白的合成。綿羊皮膚和毛囊中均有IGF-1和IGF-1R的表達，安哥拉山羊和克什米爾絨山羊皮膚也存在大量的IGF-1R。而且IGF-1是許多類型細胞防止其凋亡的存活因子。IGF-1的抗凋亡作用可能是毛囊細胞生長發(fā)育的重要因子。并且已有試驗說明異黃酮可以通過提高IGF-1的表達，從而促進毛發(fā)的生長和皮膚毛囊的形成。還有報道證明羊駝皮膚既是IGF-1作用的靶器官又是內分泌器官。但有關IGF-1及其受體IGF-1R在小鼠不同發(fā)育階段的作用的研究較少。

本試驗將以不同發(fā)育階段（3日齡、11日齡、26日齡）的小鼠作為研究對象，利用免疫組織化學方法研究IGF-1及其受體IGF-1R在不同發(fā)育階段小鼠皮膚中的分布，探討其對小鼠皮膚發(fā)育的重要作用，以期為深入研究它們在哺乳動物的皮膚生長和毛囊生長發(fā)育中的生物學功能提供理論依據。

一、試驗材料

1.試驗動物與取材。取3日齡、11日齡、26日齡小鼠的背部皮膚組織，由Bouin氏固定液固定。小鼠由山西農業(yè)大學羊駝生物工程試驗室培養(yǎng)。

2.主要試驗藥品試劑與耗材。兔抗IGF-1多克隆抗體、兔抗IGF-1R多克隆抗體、單克隆山羊抗兔二抗SABC試劑盒、DAB顯色劑等。

3.試驗方法。

（1）石蠟切片的制備。常規(guī)方法制片，片厚5微米。

處理載玻片→試驗組織修整→脫水、透明→浸蠟→包埋→修塊→切片、展片、烤片。

（2）免疫免疫組織化學試驗。按照試劑盒說明書進行試驗。

切片脫蠟與復水→孵育→磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗→封閉→滴加一抗→PBS緩沖液沖洗→滴加二抗→PBS緩沖液沖洗→滴加SABC→PBS緩沖液沖洗→DAB顯色→蘇木精復染→脫水、透明→封片。

二、圖像采集與數據分析

使用顯微鏡觀察切片，拍照采集圖像。每個樣本取3張切片，每張切片隨機選取5個視野拍照。

使用圖像分析軟件Image-Pro plus6.0，對不同日齡小鼠皮膚中IGF-1、IGF-1R蛋白的免疫組織化學結果進行光密度值測定，得出陽性細胞光密度值數據。使用SPSS16.0軟件進行數據分析統(tǒng)計。

三、試驗結果與分析

1.試驗結果。IGF-1陽性免疫反應物在3日齡小鼠皮膚中主要分布在表皮的基底層細胞和真皮結締組織中，呈陽性反應，毛囊陽性表達不明顯（圖1）；在11日齡小鼠皮膚中毛囊呈陽性反應（圖2）；在26日齡小鼠皮膚中的分布十分廣泛，各處均可見陽性反應（圖3）。

◎圖1 IGF-1在3日齡小鼠皮膚中的分布

◎圖2 IGF-1在11日齡小鼠皮膚中的分布

◎圖3 IGF-1在26日齡小鼠皮膚中的分布

IGF-1R陽性免疫反應物在3日齡小鼠皮膚中主要分布在表皮的基底層細胞和真皮結締組織中，同時，在毛囊外根鞘部分也有明顯分布，以上均呈陽性反應；在11日齡小鼠皮膚中毛囊表達明顯，呈強陽性反應；在26日齡小鼠皮膚中的表皮、真皮中均有表達，在毛囊部分弱陽性表達。

2.圖像分析及統(tǒng)計結果。分別將IGF-1、IGF-1R免疫反應物在3日齡、11日齡、26日齡小鼠皮膚中的分布情況用圖像分析軟件進行分析，得到6組試驗數據（表1），然后進行統(tǒng)計學處理，結果見圖4。

◎圖4 陽性表達的平均光密度

表1 陽性表達的平均光密度

四、討論

通過以上試驗表明，IGF-1和IGF-1R隨著日齡的增長，其含量先增加后降低，在青壯年時期達到頂峰。有文獻報道，IGF-1對肌肉中衛(wèi)星細胞的增長具有強有效的刺激作用。大量研究表明，IGF-1可抑制細胞凋亡，維持細胞存活。人、鼠、山羊、綿羊等的皮膚和毛囊中有豐富的GH-R、IGF-1和IGF-1R基因表達，IGF-1對毛生長調控起重要作用。因此，IGF-1和IGF-1R伴隨著小鼠日齡的增大其含量在皮膚中的表達應呈現變化趨勢。通過試驗發(fā)現，在3日齡小鼠皮膚中毛囊數量較少；在11日齡小鼠皮膚中毛囊數量很多，毛囊生長致密，此時小鼠被毛發(fā)育較3日齡時相比已經發(fā)生了很大的變化，11日齡小鼠被毛程度較高，在26日齡時被毛發(fā)育處在生長靜止期，開始退化，毛囊稀少。IGF-1和IGF-1R在3日齡小鼠皮膚中表達較少，在11日齡小鼠皮膚中表達較高，在26日齡時萎縮部位弱陽性表達。以上分析表明，在3～11日齡期間，小鼠毛囊處在生長初期到生長旺盛期，IGF-1、IGF-1R的含量也在不斷提高，到了26日齡時，小鼠毛囊處在生長靜止期，毛囊出現數量減少、退化的現象，IGF-1、IGF-1R的含量也開始降低。這種變化與小鼠的生長周期一致，即伴隨著被毛及個體的發(fā)育，IGF-1、IGF-1R的含量也在不斷提高，作用也越來越顯著，當到達一定時期后，被毛出現生長靜止期，IGF-1、IGF-1R含量也開始降低，作用也越來越弱。

五、結論

IGF-1、IGF-1R對小鼠皮膚和毛囊的生長發(fā)育均具有一定的作用，3～26日齡期間的小鼠的被毛中均有表達，但表達程度不同。對處在生長初期的3日齡小鼠促進作用較小，對處在生長旺盛期的11日齡小鼠促進作用明顯，表達最多。對處在生長靜止期的26日齡小鼠作用不明顯。

國家自然科學基金（項目批準號31172283）；山西農業(yè)大學2009年引進人才科研啟動項目（XB2009020）