• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高遷移率蛋白B1對(duì)肝細(xì)胞癌血管生成的影響*

    2015-12-07 07:06:06楊倩鄧菊慶馮曉潔莊利萍于璐孫潔
    關(guān)鍵詞:弱陽(yáng)性微血管陽(yáng)性細(xì)胞

    楊倩,鄧菊慶,馮曉潔,莊利萍,于璐,孫潔

    (昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院病理科,云南 昆明 650011)

    ·論著·

    高遷移率蛋白B1對(duì)肝細(xì)胞癌血管生成的影響*

    楊倩,鄧菊慶,馮曉潔,莊利萍,于璐,孫潔

    (昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院病理科,云南 昆明 650011)

    目的探討高遷移率蛋白B1(HMGB1)在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系。方法選擇30例肝細(xì)胞癌,運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HMGB1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá),并測(cè)定微血管密度,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。結(jié)果HMGB1和VEGF在肝細(xì)胞癌中呈強(qiáng)弱不等的表達(dá),總陽(yáng)性率分別為20/30(66.7%)和23/30(76.7%),高于癌旁組織及正常對(duì)照組織(P<0.05),并且HMGB1與VEGF的表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.408,P<0.05)。HMGB1與肝細(xì)胞癌微血管密度正相關(guān)(r=0.529,P=0.008);當(dāng)HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%時(shí),微血管密度無(wú)明顯增加;當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>25%時(shí),癌組織微血管密度增加。結(jié)論在肝細(xì)胞癌中,HMGB1與VEGF表達(dá)上調(diào)有關(guān),與肝細(xì)胞癌血管生成相關(guān),HMGB1可能參與了腫瘤血管生成。

    高遷移率蛋白B1;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;肝細(xì)胞癌;腫瘤血管生成;微血管密度

    高遷移族蛋白1(high mobility group protein box-1,HMGB1)在多種人類惡性腫瘤中存在高表達(dá),與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子之一。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)肝細(xì)胞癌組織中HMGB1、VEGF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),并檢測(cè)肝癌組織微血管密度(microvessel density,MVD),研究HMGB1與VEGF表達(dá)及其與微血管生成的關(guān)系,從而探討HMGB1在肝細(xì)胞癌血管生成中的作用。

    1 資料與方法

    1.1一般資料

    標(biāo)本來(lái)自2008年1月-2011年3月昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽外科的原發(fā)性肝癌患者30例。以距癌灶邊緣5 cm為分界分別留取肝癌癌灶組織和非癌組織。其中,男24例,女6例;年齡36~75歲,平均(59.6±10.5)歲;瘤體<5cm 16例,瘤體≥5cm 14例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌,術(shù)前患者未行任何治療。另取5例正常肝組織為對(duì)照組。標(biāo)本常規(guī)脫水、4%甲醛固定、石蠟包埋,連續(xù)切片(片厚4μm)。

    1.2方法

    1.2.1免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)采用SP法,兔抗人HMGB1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)PTG公司,VEGF及CD34抗體購(gòu)自美國(guó)Gene公司,SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色,以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照,以已證實(shí)HMGB1、VEGF、CD34染色陽(yáng)性的肝癌標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照。

    1.2.2微血管計(jì)量采用免疫組織化學(xué)法(同上),以CD34為指標(biāo),參考WEIDNER等[1]報(bào)道的微血管計(jì)量方法,即每一個(gè)染成棕黃色,可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織區(qū)分開的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇,不論管腔和紅細(xì)胞出現(xiàn)與否,均作為一個(gè)單一的、可計(jì)數(shù)的血管。取實(shí)驗(yàn)組織中HMGB1表達(dá)計(jì)為陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性(0,1,2,3分)的切片,于400倍視野內(nèi)計(jì)數(shù)微血管,各取5個(gè)高倍視野的均值,四舍五入后作為MVD值(微血管個(gè)數(shù)/0.42 mm2)。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲原則評(píng)定。1.2.3結(jié)果判斷①HMGB1定位于細(xì)胞質(zhì)和胞核,呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)觀察5個(gè)視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為表達(dá)陰性(-),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%~25%為表達(dá)弱陽(yáng)性(+),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%~50%為表達(dá)中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++),分別計(jì)為0,1,2,3分。②VEGF定位于細(xì)胞漿和胞膜,呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。以胞漿及胞膜著色強(qiáng)度打分:強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)為3分,陽(yáng)性計(jì)為2分,弱陽(yáng)性計(jì)為1分,陰性計(jì)為0分。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Spearman相關(guān)分析及非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1HMGB1的表達(dá)

    在30例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中,HMGB1總陽(yáng)性率為66.7%(20/30),其中強(qiáng)陽(yáng)性3例,陽(yáng)性13例,弱陽(yáng)性4例,陰性10例。癌旁組織中HMGB1總陽(yáng)性率為40%(12/30),均為弱陽(yáng)性。正常對(duì)照組織5例,無(wú)HMGB1表達(dá)。見圖1。

    圖1 免疫組織化學(xué)顯示HMGB1在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá),定位于細(xì)胞核(×100)

    2.2VEGF的表達(dá)

    在30例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中,VEGF總陽(yáng)性率為76.7%(23/30),其中強(qiáng)陽(yáng)性7例,中度陽(yáng)性13例,弱陽(yáng)性3例,陰性7例。癌旁組織中VEGF總陽(yáng)性率為46.7%(14/30),均為弱陽(yáng)性。正常對(duì)照組織5例,2例出現(xiàn)小灶狀VEGF弱表達(dá)。在血管和膽管中有時(shí)可見VEGF弱表達(dá)。見圖2。

    圖2 免疫組織化學(xué)顯示VEGF在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá),定位于胞漿(×100)

    2.3HMGBI與VEGF表達(dá)的關(guān)系

    在同一個(gè)病例中,HMGB1和VEGF的表達(dá)是不均一的,可以表現(xiàn)為部分肝細(xì)胞陽(yáng)性而部分為陰性;然而,在這些病例里發(fā)現(xiàn),HMGB1和VEGF在同一部位有著相似的表達(dá),同為陰性或同為陽(yáng)性。見圖3~6。

    對(duì)于多個(gè)區(qū)域的HMGB1和VEGF的強(qiáng)度表達(dá)進(jìn)行采樣及分析,采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行

    Spearman相關(guān)分析,HMGB1與VEGF表達(dá)存在相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)r=0.408,P=0.025。

    圖3 HMGB1在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)(×40)

    圖4 在肝細(xì)胞癌中,VEGF與HMGB1的陽(yáng)性表達(dá)一致(×40)

    圖5 HMGB1在部分膽管上皮內(nèi)可呈陽(yáng)性表達(dá)(×100)

    圖6 VEGF在同一膽管上皮內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)(×100)

    2.4HMGBI與微血管密度的關(guān)系

    在20例有HMGB1表達(dá)的病例中,選取癌組織表達(dá)HMGB1為陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性(0,1,2,3分)的視野,進(jìn)行微血管密度測(cè)定及分析。結(jié)果:HMGB1與微血管密度正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r= 0.529,P=0.008);HMGB1陰性與HMGB1弱陽(yáng)性組微血管密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(秩均值5.67、6.78,P=0.643>0.05);中度陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性組微血管密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(秩均值6.94、5.17;P=0.459>0.05);弱陽(yáng)性與中度陽(yáng)性組微血管密度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(秩均值5.83、13.17;P=0.004<0.05),弱陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性組微血管密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(秩均值5.06、10.83;P=0.016<0.05)。在肝細(xì)胞癌中,當(dāng)HMGB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%時(shí),微血管密度無(wú)明顯增加;當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>25%時(shí),癌組織微血管密度增加。見圖7。

    圖7 肝細(xì)胞癌微血管密度增加(×200)

    3 討論

    HMGB1最初發(fā)現(xiàn)時(shí)是一種廣泛存在的DNA結(jié)合蛋白,一般情況下,HMGB1在多數(shù)細(xì)胞中呈基礎(chǔ)水平表達(dá),它參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)HMGB1可作為一種細(xì)胞因子,在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞受內(nèi)毒素、IL-1、TNF刺激后均能釋放。HMGB1還可由受損或壞死細(xì)胞釋放。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展研究方面,已發(fā)現(xiàn)HMGB1與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。

    一些報(bào)道提示,HMGB1與腫瘤血管生成有關(guān):HMGB1及其受體RAGE的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活,進(jìn)而使白細(xì)胞黏附分子和前炎癥反應(yīng)分子及血管生成因子表達(dá)上調(diào)[3];HMGB1與肝磷脂形成的復(fù)合物也能促進(jìn)血管生成[4];在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中,人們利用抗體封閉HMGB1后,發(fā)現(xiàn)血管生成受到抑制[5]。MITOLA等[6]報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中,HMGB1可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的MAPK細(xì)胞外信號(hào)調(diào)解激酶(EPK)1/2信號(hào)活化,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、修復(fù)機(jī)械性受損的內(nèi)皮細(xì)胞。HMGB1也可以通過(guò)直接活化內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞,動(dòng)員其遷移至缺血區(qū)域,來(lái)促進(jìn)血管新生[7]。

    VEGF是目前比較明確的血管生長(zhǎng)因子,癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成,VEGF在肝癌中高表達(dá),對(duì)肝癌新生血管形成及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起

    重要作用。在鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、腎母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中,HMGB1與VEGF的關(guān)系已有文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。在肝細(xì)胞癌中,也發(fā)現(xiàn)HMGB1與微血管生成相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1與VEGF-A的生成相關(guān),阻斷HMGB1通路使得視網(wǎng)膜細(xì)胞株(RGC-5)中VEGFA減少[11]。SASAHIRA等運(yùn)用重組人HMGB1蛋白作用于口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá),亦從體外細(xì)胞水平為HMGB1參與到腫瘤血管生成過(guò)程中提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)[12]。

    本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與VEGF蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān),提示在肝細(xì)胞癌血管生成過(guò)程中,異常表達(dá)增高的HMGB1與VEGF存在相關(guān)性。可能存在HMGB1為促血管生成因子VEGF的上調(diào)提供了協(xié)同作用。另外,當(dāng)HMGB1表達(dá)達(dá)到一定程度(>25%)時(shí),癌組織微血管密度增加,提示HMGB1對(duì)腫瘤新生血管的作用可能在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。HMGB1可作為評(píng)估肝細(xì)胞癌腫瘤血管生成的一個(gè)觀測(cè)指標(biāo),可能成為阻斷肝癌血管生成的有效靶點(diǎn)。

    [1]WEI DNER N.Chapter 14.Measuring intratumoral microvessel density[J].Methods Enzymol,2008,444:305-323.

    [2]陳艷美,賀福初,林成招.HMGB1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)癌癥雜志,2012,22(10):784-789.

    [3]VAN BEIJNUM JR,BUURMAN WA,GRIFFIOEN AW.Convergence and amplification of toll-like receptor(TLR)and receptor for advanced glycation end products(RAGE)signaling pathways via high mobility group B1(HMGB1)[J].Angiogenesis,2008,11(1): 91-99.

    [4]WAKE H,MORI S,LIU K,et al.Histidine-rich glycoprotein inhibited high mobility group box 1 in complex with heparin-induced angiogenesis in matrigel plug assay[J].Eur J Pharmacol, 2009,623(1-3):89-95.

    [5]VAN BEIJNUM JR,DINGS RP,VAN DER LINDEN E,et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected:specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature[J].Blood,2006,108(7): 2339-2348.

    [6]MITOLA S,BELLERI M,URBINATI C,et al.Cutting edge:extracellular high mobility group box-1 protein is a proangiogenic cytokine[J].J.Immunol,2006,176(1):12-15.

    [7]CHAVAKIS E,HAIN A,VINCI M,et al.High-mobility group box 1 activates integrin-dependent homing of endothelial progenitor cells[J].Circ Res,2007,100(2):204-212.

    [8]李焱,蔣勇,史立群,等.HMGB1和VEGF-C/D在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(11): 1237-1239.

    [9]張大,張國(guó)鋒,王家祥,等.兒童腎母細(xì)胞瘤HMGB1、RAGE及VEGF的表達(dá)及意義[J].中華小兒外科雜志,2011,32(7):534-538.

    [10]周寶勇.HMGB1在肝癌中的表達(dá)及其與VEGF,MVD的關(guān)系[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,37(5):409-412.

    [11]LEE JJ,HSIAO CC,YANG IH,et al.High-mobility group box 1 protein is implicated in advanced glycation end products-induced vascular endothelial growth factor A production in the rat retinal ganglion cell line RGC-5[J].Mol Vis,2012,18:838-850.

    [12]SASAHIRA T,KIRITA T,BHAWAL UK,et al.The expression of receptor for advanced glycation end products is associated with angiogenesis in human oral squamous cell carcinoma[J]. Virchows Arch,2007,450(3):287-295.

    (張蕾 編輯)

    Effect of high moboility group box 1 protein on angiogenesis in hepatocellular carcinoma*

    Qian YANG,Ju-qing DENG,Xiao-jie FENG,Li-ping ZHUANG,Lu YU,Jie SUN
    (The Affiliated Galmette Hostpital,Kunming Medical University, Kunming,Yunnan 650011,P.R.China)

    【Objective】To investigate the expression of high mobility group box 1 protein(HMGB1)in hepatocellular carcinoma and its relationship to tumor angiogenesis.【Methods】The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of HMGB1 and vascular endothelial growth factor(VEGF)in the hepatocellular carcinoma tissue and paracancerous tissue of 30 patients.Microvessel density(MVD)was also measured.【Results】With high or low intensity,HMGB1 was expressed in the cancenoma tissue of 20 cases(66.7%)and VEGF in the cancenoma tissue of 23 cases(76.7%)among the 30 hepatocellular carcinoma patients,the positive rates were significantly higher than those of the pericarcinous tissue(40%,46.7%)and non-cancerous tissue(P<0.05).The expression of HMGB1 was related with VEGF(r=0.408,P<0.05). HMGB1 also related to MVD(r=0.529,P=0.008),MVD increased when the positive rate of HMGB1 was greater than 25%.【Conclusions】HMGBl and VEGF are closely correlated in hepatocellular carcinoma. HMGB1 may be involved in angiogenesis of hepatocellular carcinoma.

    high moboility group box 1 protein(HMGB1);vascular endothelial growth factor;hepatocellular carcinoma;angiogenesis;microvessel density

    R735.7

    A

    1005-8982(2015)24-0005-04

    2015-04-10

    云南省教育廳科學(xué)研究基金(No:2011C088)

    猜你喜歡
    弱陽(yáng)性微血管陽(yáng)性細(xì)胞
    乙型肝炎表面抗原弱陽(yáng)性的檢測(cè)分析
    乙型肝炎病毒與肝細(xì)胞癌微血管侵犯的相關(guān)性
    大口黑鱸鰓黏液細(xì)胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的分布
    膠體金法檢測(cè)梅毒抗體價(jià)值及弱陽(yáng)性影響因素分析
    IMP3在不同宮頸組織中的表達(dá)及其與微血管密度的相關(guān)性
    上皮性卵巢癌組織中miR-126、EGFL7的表達(dá)與微血管密度的檢測(cè)
    自制弱陽(yáng)性質(zhì)控品對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血者進(jìn)行ABO血型鑒定室內(nèi)質(zhì)控的可行性探討
    人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育性變化
    酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙肝表面抗原弱陽(yáng)性結(jié)果分析與報(bào)告
    顯微血管減壓術(shù)治療面肌痙攣的臨床觀察
    99国产精品99久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日韩有码中文字幕| 视频区图区小说| 大香蕉久久成人网| 成人手机av| 1024视频免费在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 视频在线观看一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男男h啪啪无遮挡| 激情视频va一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 波多野结衣一区麻豆| 国产男女内射视频| av不卡在线播放| 操美女的视频在线观看| 我的亚洲天堂| 亚洲专区国产一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美日韩成人在线一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 97精品久久久久久久久久精品| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美国产精品一级二级三级| 久热爱精品视频在线9| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 天天添夜夜摸| 成人国产av品久久久| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 91九色精品人成在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 永久免费av网站大全| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品熟女久久久久浪| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲中文av在线| 亚洲人成电影免费在线| 91麻豆av在线| www.精华液| 久久ye,这里只有精品| 两个人看的免费小视频| 日本av手机在线免费观看| 国产一区二区 视频在线| 亚洲色图综合在线观看| 咕卡用的链子| 手机成人av网站| 国产亚洲av高清不卡| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲专区中文字幕在线| tube8黄色片| av视频免费观看在线观看| 十八禁网站免费在线| 免费观看人在逋| 男人操女人黄网站| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美一级毛片孕妇| 十分钟在线观看高清视频www| 老司机午夜十八禁免费视频| 99香蕉大伊视频| 两人在一起打扑克的视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品av久久久久免费| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲九九香蕉| 一二三四社区在线视频社区8| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 色94色欧美一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久国产一区二区| 国产黄频视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品福利观看| 青青草视频在线视频观看| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品成人免费网站| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一区二区三区四区激情视频| 精品久久蜜臀av无| 后天国语完整版免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜激情av网站| 午夜日韩欧美国产| 国产精品一区二区在线不卡| 日本vs欧美在线观看视频| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧美精品自产自拍| 在线天堂中文资源库| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 12—13女人毛片做爰片一| www日本在线高清视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产真人三级小视频在线观看| 91字幕亚洲| 不卡一级毛片| 国产免费视频播放在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美一级毛片孕妇| 国产国语露脸激情在线看| a在线观看视频网站| 久久中文字幕一级| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 老熟妇仑乱视频hdxx| 又紧又爽又黄一区二区| 精品久久久精品久久久| 91老司机精品| 国产精品免费大片| 国产97色在线日韩免费| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品自拍成人| 一个人免费在线观看的高清视频 | 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲,欧美精品.| 成年动漫av网址| 日本91视频免费播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 精品高清国产在线一区| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久这里只有精品19| 最黄视频免费看| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利免费观看在线| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲视频免费观看视频| av在线老鸭窝| 97在线人人人人妻| 自线自在国产av| 999精品在线视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品福利观看| 亚洲一区中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| av国产精品久久久久影院| 丰满迷人的少妇在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| svipshipincom国产片| 99久久99久久久精品蜜桃| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 丝袜美腿诱惑在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | av不卡在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 午夜福利一区二区在线看| 免费在线观看完整版高清| 国产成人系列免费观看| 午夜福利免费观看在线| 色精品久久人妻99蜜桃| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产成人免费无遮挡视频| av免费在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日本欧美视频一区| 国产免费现黄频在线看| 伊人亚洲综合成人网| 91成年电影在线观看| 久久久久久久国产电影| 窝窝影院91人妻| 高清av免费在线| 久久久国产一区二区| 亚洲国产欧美在线一区| 人人澡人人妻人| 又黄又粗又硬又大视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产伦人伦偷精品视频| tube8黄色片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久久久久久久大奶| 国产欧美日韩一区二区三 | 99热全是精品| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美日韩亚洲高清精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 黑人猛操日本美女一级片| 免费av中文字幕在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久热在线av| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文字幕av电影在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久国产精品男人的天堂亚洲| av视频免费观看在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 岛国毛片在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 这个男人来自地球电影免费观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 国产成人欧美在线观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美午夜高清在线| 国产在线免费精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美一级毛片孕妇| 久久国产精品人妻蜜桃| 日日爽夜夜爽网站| 美国免费a级毛片| 国产精品99久久99久久久不卡| 妹子高潮喷水视频| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本黄色日本黄色录像| cao死你这个sao货| 国产成人啪精品午夜网站| a 毛片基地| 亚洲精品第二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产91精品成人一区二区三区 | 一二三四社区在线视频社区8| 黄色片一级片一级黄色片| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久国产电影| kizo精华| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 男女边摸边吃奶| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜久久久在线观看| 一级毛片女人18水好多| 亚洲专区字幕在线| 97精品久久久久久久久久精品| 午夜精品国产一区二区电影| tube8黄色片| 精品乱码久久久久久99久播| 91成年电影在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品熟女少妇八av免费久了| 老司机福利观看| 黄色怎么调成土黄色| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜两性在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美午夜高清在线| 国产精品一区二区在线观看99| 老鸭窝网址在线观看| 一进一出抽搐动态| 国产精品欧美亚洲77777| av国产精品久久久久影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美在线黄色| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中国美女看黄片| 99久久精品国产亚洲精品| 男女国产视频网站| 黑人操中国人逼视频| 麻豆乱淫一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕人妻丝袜制服| 男人操女人黄网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久 成人 亚洲| 下体分泌物呈黄色| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品国产av在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文欧美无线码| 久久久久国产一级毛片高清牌| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av在线老鸭窝| 亚洲精品美女久久av网站| 交换朋友夫妻互换小说| 视频在线观看一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品一区二区免费欧美 | 日韩三级视频一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 我的亚洲天堂| 国产亚洲av高清不卡| avwww免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品免费大片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产一区二区激情短视频 | 无限看片的www在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲七黄色美女视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 青春草亚洲视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 亚洲 国产 在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 人成视频在线观看免费观看| 操美女的视频在线观看| 免费在线观看日本一区| 国产亚洲av高清不卡| 日韩电影二区| 欧美激情高清一区二区三区| 日本一区二区免费在线视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲欧美在线一区二区| 青草久久国产| av一本久久久久| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 日本黄色日本黄色录像| 最新的欧美精品一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 在线观看舔阴道视频| 久久久久久久国产电影| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲综合色网址| 国产亚洲精品一区二区www | 成年人黄色毛片网站| www.精华液| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 捣出白浆h1v1| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品一区二区在线不卡| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人系列免费观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久青草综合色| 蜜桃国产av成人99| 欧美激情 高清一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 搡老熟女国产l中国老女人| 99国产极品粉嫩在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 三级毛片av免费| av不卡在线播放| 国产成人欧美| 午夜福利,免费看| 69精品国产乱码久久久| 黑人操中国人逼视频| 久久av网站| 国产区一区二久久| 久久人人爽人人片av| 亚洲,欧美精品.| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 中文字幕制服av| 国产在线免费精品| 国产成人av教育| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | av片东京热男人的天堂| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av一本久久久久| 久久 成人 亚洲| 欧美国产精品va在线观看不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 婷婷色av中文字幕| 国产野战对白在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲久久久国产精品| 香蕉丝袜av| 嫁个100分男人电影在线观看| 热99re8久久精品国产| 国产精品免费大片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲成人国产一区在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| av视频免费观看在线观看| 黄片大片在线免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 丁香六月天网| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 男女国产视频网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 国产一区二区在线观看av| www日本在线高清视频| 欧美午夜高清在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品乱码久久久久久99久播| 日韩欧美免费精品| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 日韩视频一区二区在线观看| 成人国产av品久久久| 69精品国产乱码久久久| 久久 成人 亚洲| 丁香六月天网| 亚洲黑人精品在线| 欧美精品av麻豆av| 国产成人欧美| 91成年电影在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| a级毛片黄视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 9色porny在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 性色av一级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 夫妻午夜视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| www.熟女人妻精品国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品av麻豆av| 极品少妇高潮喷水抽搐| 美女大奶头黄色视频| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久久久久国产电影| 成在线人永久免费视频| 国产精品免费大片| 久久久久网色| 岛国毛片在线播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 老汉色av国产亚洲站长工具| e午夜精品久久久久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 视频区欧美日本亚洲| 91麻豆av在线| 国产深夜福利视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 男人舔女人的私密视频| 天堂中文最新版在线下载| av在线播放精品| 午夜福利视频在线观看免费| 一区二区三区精品91| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品人妻在线不人妻| 桃花免费在线播放| 少妇 在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中国国产av一级| 一个人免费看片子| 欧美精品一区二区免费开放| 91九色精品人成在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 成人国产av品久久久| 成人影院久久| 亚洲成人免费av在线播放| 中国美女看黄片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 宅男免费午夜| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 色94色欧美一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 丁香六月天网| 午夜精品久久久久久毛片777| 女性被躁到高潮视频| 啦啦啦 在线观看视频| 成人影院久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久香蕉激情| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 色94色欧美一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 青春草视频在线免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本一区二区免费在线视频| 不卡一级毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利,免费看| 多毛熟女@视频| av线在线观看网站| 欧美日韩福利视频一区二区| 五月天丁香电影| 国产伦人伦偷精品视频| 91老司机精品| 在线永久观看黄色视频| 在线av久久热| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲美女黄色视频免费看| 五月天丁香电影| 99re6热这里在线精品视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久精品区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲成人手机| 国产三级黄色录像| 伦理电影免费视频| 考比视频在线观看| e午夜精品久久久久久久| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av国产av综合av卡| 老司机影院成人| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 大码成人一级视频| 免费黄频网站在线观看国产| 久9热在线精品视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久国产亚洲av麻豆专区| 十八禁网站免费在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 99精品久久久久人妻精品| 飞空精品影院首页| 午夜福利在线观看吧| 久久国产精品影院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 美国免费a级毛片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 免费在线观看完整版高清| 欧美大码av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲成人免费av在线播放| 性少妇av在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲欧美精品自产自拍| 9191精品国产免费久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 人妻一区二区av| 久久午夜综合久久蜜桃| av视频免费观看在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费少妇av软件| 久久久国产一区二区| 十八禁高潮呻吟视频| 中文字幕色久视频| 老熟女久久久| 女人精品久久久久毛片| 国产高清视频在线播放一区 | 老司机影院成人| 永久免费av网站大全| 美国免费a级毛片| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品av久久久久免费| 精品高清国产在线一区| 国产男女超爽视频在线观看| 久久 成人 亚洲| 久久女婷五月综合色啪小说| 国精品久久久久久国模美| 大香蕉久久网| 看免费av毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久久久久久精品精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 天堂8中文在线网| 亚洲精品美女久久av网站| 看免费av毛片| 亚洲中文av在线| 人妻人人澡人人爽人人|