超聲波法提取赤水河流域竹葉黃酮工藝研究

朱萬強(qiáng)，張清榕

（遵義師范學(xué)院a.化學(xué)化工學(xué)院b.黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563002）

超聲波法提取赤水河流域竹葉黃酮工藝研究

朱萬強(qiáng)，張清榕

（遵義師范學(xué)院a.化學(xué)化工學(xué)院b.黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563002）

用超聲波-乙醇水溶液提取法對(duì)竹葉黃酮的提取方法進(jìn)行了研究；通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察了影響實(shí)驗(yàn)的各個(gè)因素：乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為70%，料液比為1:20，每次超聲時(shí)間為15min，超聲3次時(shí)提取效果最好。對(duì)赤水河流域7種竹葉的黃酮含量用分光光度法進(jìn)行了測定.

赤水河流域；竹葉黃酮;超聲提取;分光光度法

黃酮類化合物又叫生物類黃酮，是一類重要的有機(jī)化合物，廣泛存在于植物界，主要分布在高等植物中，在藻類、菌類等低等植物中很少發(fā)現(xiàn)[1]。許多研究已經(jīng)證明，黃酮類化合物具有多種生物活性，除了在消炎、抗菌、抗肝臟病毒、解痙、止瀉、利尿、鎮(zhèn)靜等方面的作用外，在防癌、抗過敏、抗腫瘤、防治高血壓等方面也有明顯作用。黃酮類化合物可以從維生素含量高或微量元素含量高的食物中獲得，如豆類、橙類、洋蔥，也可以從富含黃酮類化合物的植物中提取，作為膳食補(bǔ)充劑制成各種保健食品。其中竹葉黃酮是20世紀(jì)90年代新開發(fā)的以高山野生淡竹葉為原料的一種植物類黃酮制劑[2]。

目前，竹葉黃酮除了作為天然食品抗氧化劑、天然植物飼料添加劑、生物殺蟲劑以及廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)外，還被用于開發(fā)研制防治心腦血管疾病的新型藥物[3]。毫無疑問，盛產(chǎn)竹子的地區(qū)對(duì)于竹葉黃酮的開發(fā)利用及提取研究占有絕對(duì)優(yōu)勢，我國盛產(chǎn)竹子的地區(qū)很多，貴州省赤水河流域就是其中之一，該地因盛產(chǎn)竹子而被譽(yù)為“竹子王國”。

赤水河主要流經(jīng)貴州遵義北部，該地氣候類型為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候[4]。該地區(qū)有著適合竹子生長的氣候、土壤等優(yōu)良條件，豐富的竹子資源給工業(yè)

生產(chǎn)發(fā)展提供了得天獨(dú)厚的條件，赤水地區(qū)是貴州省主要的工業(yè)原料林基地。竹業(yè)加工產(chǎn)品如竹地板、竹筷、竹工藝品等在赤水市竹林行業(yè)有著舉足輕重的作用。對(duì)竹葉黃酮的開發(fā)利用一直受到人們的關(guān)注，但貴州地區(qū)雖然有人對(duì)竹葉黃酮進(jìn)行研究，但卻沒有引起更多的注意，離產(chǎn)業(yè)化的要求更遠(yuǎn)。我們決定選取赤水河流域的部分竹子品種對(duì)其竹葉黃酮的含量和提取方法進(jìn)行研究，以期為下一步的實(shí)際利用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮刺竹、慈竹、苦竹、楠竹、水竹、白夾竹、粽竹葉，2013年7月采自赤水河流域。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)干燥箱80℃干燥半小時(shí)，干燥后樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過90目篩，收集粉末置于棕色試劑瓶中待用．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

202-0型臺(tái)式干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、CX-200型高速多功能粉碎機(jī)（上海緣沃工貿(mào)有限公司）、722S型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SG5200HD型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）、TB-214型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.3 試劑

蘆丁（上海源葉生物科技有限公司）、無水乙醇（99.7%）、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁，所有試劑均為分析純。

1.4 分光光度法

1.4.1 吸收波長選取

對(duì)竹葉黃酮的提取及含量測定方法已經(jīng)比較成熟，主要是通過測定蘆丁含量來實(shí)現(xiàn)[5-6]。

蘆丁對(duì)紫外光和可見光都有吸收。文獻(xiàn)報(bào)道其在紫外區(qū)的吸收波長為370nm[7]。在可見光區(qū)的吸收波長，一般采用的是510nm[8]，理由是在此波長下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在按下述順序補(bǔ)足各溶液后，蘆丁對(duì)該波長的光吸收最大?；诖耍瑖鴥?nèi)很多文獻(xiàn)在報(bào)道測定蘆丁的吸收波長時(shí)，一般都直接選定為510nm。對(duì)此，稍早的報(bào)道也有將測定波長選定在420nm處[9]。針對(duì)這種情況，我們將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收波長，重新進(jìn)行了測定。

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0188g，用30%的酒精溶液定容至50mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.376g/L的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5mL于6只25mL容量瓶中，標(biāo)號(hào)為1～6，加30%酒精溶液補(bǔ)充至12.5mL，加入0.7mL質(zhì)量濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min后加入0.7mL質(zhì)量濃度為1%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后加入5 mL質(zhì)量濃度為1mol/L的NaOH溶液，搖勻，用30%酒精溶液定容，搖勻，靜置10 min后，選取3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液于不同波長下測定吸光度，測定結(jié)果如表1所示。

表1 3號(hào)試樣溶液在不同波長下的吸光度

由表1數(shù)據(jù)可以看出，標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液在波長為490nm下吸收最大，干擾最小，所以在實(shí)驗(yàn)中我們選取490nm作為實(shí)驗(yàn)的最大吸收波長。

1.4.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

調(diào)節(jié)波長為490nm，以1號(hào)容量瓶的試樣為空白參比，將上述配制好的其它標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液用比色法測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[8-10]。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=9.2587x+0.0069，R2=0.9985，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 竹葉黃酮的提取及檢測

1.5.1 單因素對(duì)竹葉黃酮提取的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前對(duì)竹葉黃酮的提取方法有多種：索氏抽提法，乙醇浸提法，熱水浸提法，溶劑超聲提取法等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在此不再贅述。乙醇具有溶解力較強(qiáng)，無毒，易得等優(yōu)點(diǎn)；超聲波具有不用加熱、易于操作的特性。本研究用乙醇-超聲

波提取法提取竹葉黃酮。影響該方法的因素主要有超聲時(shí)間、超聲功率、超聲次數(shù)、料液比、乙醇濃度。一般超聲設(shè)備的功率選項(xiàng)不是太多，我們固定在某一頻率，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)的因素水平和控制實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

（1）乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

采用1:20的料液比例，準(zhǔn)確稱取2克左右某一品種（水竹）已粉粹的竹葉，按前述竹葉黃酮的提取方法，分別用不同濃度的乙醇在同樣超聲條件下得黃酮樣品提取液。每種樣品液各取2mL，按前述竹葉黃酮含量檢測方法要求，測定其吸光度，結(jié)果見表2。

表2 不同乙醇濃度(v/v%)對(duì)吸光度的影響

由表2可以看出，乙醇濃度為70%時(shí)，吸光度最大。以70%的乙醇濃度提取最好。乙醇濃度增加導(dǎo)致吸光度下降，可能是由于隨著乙醇濃度的增加，竹葉中其它乙醇可溶物如色素等雜質(zhì)也隨著溶出，并同乙醇-水分子結(jié)合，導(dǎo)致黃酮溶出率下降，因而吸光度下降。

（2）超聲時(shí)間的影響

采用1:20的料液比例，準(zhǔn)確稱取2克左右某一品種已粉粹的竹葉，按前述竹葉黃酮的提取方法，用70%濃度的乙醇，按同一超聲輸出頻率，在不同的超聲時(shí)間條件下得黃酮樣品提取液。再取每種樣品液各2mL，按前述竹葉黃酮含量檢測方法要求，測定其吸光度，結(jié)果見表3。

表3 不同超聲時(shí)間（min）對(duì)吸光度的影響

由表3可以看出，超聲時(shí)間以20min為最佳。時(shí)間延長，超聲波可能使黃酮部分分解而導(dǎo)致吸光度下降。

（3）超聲次數(shù)的影響

采用1:20的料液比例，準(zhǔn)確稱取2克左右某一品種已粉粹的竹葉，按前述竹葉黃酮的提取方法，用70%濃度的乙醇，按同一超聲輸出頻率，每次超聲20min，然后在不同的超聲次數(shù)條件下得黃酮樣品提取液。取每種樣品液各2mL，按前述竹葉黃酮含量檢測方法要求，測定其吸光度，結(jié)果見表4。

表4 不同超聲次數(shù)對(duì)吸光度的影響

從表4可以看出，超聲次數(shù)以3次為好?？紤]到超聲3次與超聲2次的效果相差不大，并且多超聲一次，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)要產(chǎn)生較大影響，因此以超聲2次為宜。

（4）料液比的影響

準(zhǔn)確稱取2克左右某一品種已粉粹的竹葉，按前述竹葉黃酮的提取方法，采用70%的乙醇濃度，在同樣超聲條件下，分別采用不同的料液比（竹葉樣品/乙醇）得黃酮樣品提取液。每種樣品液各取2mL，按前述竹葉黃酮含量檢測方法要求，測定其吸光度，結(jié)果見表5。

表5 不同料液比（質(zhì)量g/體積mL）對(duì)吸光度的影響

從表5可以得出，料液比以1:20為最好。

1.5.2 正交因素水平實(shí)驗(yàn)對(duì)竹葉黃酮提取的影響

將前述乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)與料液比四個(gè)因素，設(shè)計(jì)一個(gè)四因素三水平的正交表結(jié)果見表6。

各因素的影響順序?yàn)锽〉C〉D〉A(chǔ)，最佳組合為A2B2C3D2。即乙醇濃度為70%，超聲時(shí)間為15min，超聲次數(shù)為3次，料液比為1:20。正交實(shí)驗(yàn)時(shí)，三個(gè)水平間間隔為5min，總時(shí)間與在單因素時(shí)所得到的結(jié)果基本相符。由于選擇的乙醇濃度已經(jīng)接近最佳濃度，因此在正交實(shí)驗(yàn)中，并不是主要的影響因素。得到的實(shí)驗(yàn)條件與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的條件基本一致。

1.5.3 對(duì)幾種竹葉黃酮的提取實(shí)驗(yàn)

精確稱取粉碎好的赤水河流域的楠竹葉、水竹葉、白夾竹葉、苦竹葉、刺竹葉、慈竹葉，粽葉粉末各5.0000g，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳實(shí)驗(yàn)條件，即分別加70%酒精溶液100mL，用超聲波提取3次，每次15分鐘，過濾，合并濾液，定容至100mL容量瓶中。取2.0mL樣品溶液于25mL容量瓶中，加30%酒精溶液補(bǔ)充至12.5mL，加入0.7mL質(zhì)量濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置5min后加入0.7mL質(zhì)量濃度為1%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后加入5 mL質(zhì)量濃度為1mol/L的NaOH溶液，搖勻，用30%酒精溶液定容，搖勻，靜置10 min后，于波長為490nm處用比色法測定吸光度，以不加樣品溶液的試樣為空白參比，測得各種竹葉中黃酮的吸光度如表7所示。

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

3 結(jié)語

用70%乙醇，1:20料液比，超聲波提取3次（實(shí)際操作2次），每次15分鐘可有效提取竹葉黃酮。赤水河流域的7種竹葉中，黃酮含量最高的楠竹為17.45mg/g；其次為白夾竹16.31mg/g、刺竹13.94mg/ g、苦竹13.07 mg/g、慈竹10.72 mg/g、水竹9.16 mg/ g、粽葉6.19 mg/g。

表7 竹葉中黃酮的吸光度

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（責(zé)任編輯：朱 彬）

A Study of Technology in Extracting Flavones from Bambooleaf Grown in Chi-shui River Valley by Ultrasonic Wave

ZHU Wang-qiang,ZHANG Qing-rong
(1.Chemistry and Chemical Technology Institute;2.Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei,Zunyi Normal College,Zunyi 563002,China)

By meansof ulitrasonic waveandalcoholsolution,the authorofthis paper makesa study of theapproach to extracting flavones from bamboo-leaf.L9(34)orthogonal experiment was used to investigate various factors influencing the experiment,such as acohol concentration,solid-liquid ratio,time,etc.The findings show that the extraction is optional when alcohol concentration is 70%,ultrasonics is 3 times,every time lasts 15 minutes,and the ratio of solid/liquid is 1:20.Flavones were determined from 7 kinds of bamboos leaves grown in Chi-shui River valley by spctrophotometry.

Chi-shui River valley;flavones from bamboos leaves;ultrasonic wave extracting;spctrophotometry;

TQ461

A

1009-3583（2015）-0099-04

2014-12-11

貴州省科學(xué)基金資助項(xiàng)目（黔科合J字LKZS[2012]27號(hào)）

朱萬強(qiáng)，男，貴州遵義人，遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院教授。研究方向：應(yīng)用化學(xué)。