關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因的分子特征及其組織表達(dá)分析

石鵬飛，阮涌，劉文嬌，許家利，孫金魁，熊訊，許厚強(qiáng)

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)試驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

0 引言

【研究意義】脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs）是一類與脂肪酸高度親和的小分子蛋白，其分子量為14～15 kD，由126～134個(gè)氨基酸殘基組成，在脊椎和非脊椎動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)中廣泛表達(dá)（Niewold et al.，2004；Wang et al.，2005；熊訊等，2022）。FABPs對(duì)脂肪酸的調(diào)控機(jī)制是通過與長(zhǎng)鏈脂肪酸特異結(jié)合，從而將細(xì)胞膜上的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至磷脂和甘油三酯的代謝位置（Di Pietro and Santome，2001；Ono and Odani，2010）。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP，F(xiàn)ABP3）與脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（AFABP，F(xiàn)ABP4）是FABPs家族的重要組成成員。因此，探究牛FABP3和FABP4基因的分子生物學(xué)特征及其組織表達(dá)特性，可為進(jìn)一步揭示FABP3和FABP4對(duì)脂肪酸的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】FABPs與過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）共同作用調(diào)控胞內(nèi)脂肪酸的合成及分解，以維持體內(nèi)葡萄糖和脂肪的平衡（Kusudo et al.，2015）。FABP3基因主要在心臟組織中表達(dá)，能與血漿長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合，參與心肌及骨骼肌中脂肪酸的運(yùn)輸和利用（Zhang et al.，1999）。敲除FABP3基因的小鼠表現(xiàn)出心肌細(xì)胞無(wú)法有效利用血漿中的長(zhǎng)鏈脂肪酸，從而影響心肌細(xì)胞功能（Binas et al.，1999）。此外，有研究表明FABP3基因?qū)τ谛∈笞厣窘M織的耐寒性和脂肪酸的氧化不可或缺（Vergnes et al.，2011）。FABP4基因高表達(dá)于脂肪細(xì)胞中，是甘油三酯的貯存庫(kù)，在甘油三酯的合成及分解過程中發(fā)揮重要作用（Prentice et al.，2019）；且FABP4分子中心具有與脂肪酸高度親和的結(jié)合位點(diǎn)，能通過非共價(jià)鍵與長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合而有利于脂肪酸溶解（Smith et al.，2007）。FABP4基因敲除小鼠的生理狀態(tài)表現(xiàn)正常，但其血漿中的膽固醇和甘油三酯水平明顯降低（Uysal et al.，2000）。在3T3細(xì)胞中，過表達(dá)FABP3基因具有促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞成脂的作用（Yi et al.，2014）；而過表達(dá)FABP4基因能增強(qiáng)線粒體功能，同時(shí)促進(jìn)脂質(zhì)沉積及脂肪細(xì)胞分化（談笑，2014）。肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）是肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其含量直接影響肉質(zhì)嫩度、適口性和風(fēng)味（Hocquette et al.，2010）。Gerbens等（2000）研究表明豬FABP3基因遺傳多態(tài)性與IMF含量呈正相關(guān)；Lim等（2015）研究證實(shí)牛FABP3基因表達(dá)水平在低IFM組和高IMF組間存在顯著差異；Wang等（2015）研究發(fā)現(xiàn)FABP3和FABP4是影響肉質(zhì)的重要基因，且FABP3基因表達(dá)水平與山羊IMF含量顯著相關(guān)；Bartoň等（2016）研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FABP4基因?qū)ε＜?nèi)脂肪細(xì)胞的生成有顯著影響；Yan等（2018）研究證實(shí)，綿羊FABP4基因在脂肪細(xì)胞分化過程中顯著上調(diào)表達(dá)，且其基因多態(tài)性與IMF含量顯著相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)FABP3和FABP4基因在豬和羊上的研究較多報(bào)道，但針對(duì)牛FABP3和FABP4基因的具體分子結(jié)構(gòu)、功能及相互作用尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過在線生物信息學(xué)分析軟件分析關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因的分子結(jié)構(gòu)及其功能，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)這2個(gè)基因在不同年齡段和不同組織中的表達(dá)差異，為揭示牛FABP3和FABP4基因?qū)χ舅岬恼{(diào)控作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物來自貴州省安順市關(guān)嶺縣關(guān)嶺牛產(chǎn)業(yè)園，隨機(jī)選取相同飼養(yǎng)條件下的3日齡關(guān)嶺犢牛、24月齡關(guān)嶺牛（成年）及24月齡雜交牛（關(guān)嶺?！晾举澟＃└?頭，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長(zhǎng)肌、脂肪及小腸等組織樣品，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饕囼?yàn)試劑：TRIzol購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR StarMix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GenStar）購(gòu)自西寶生物科技（上海）股份有限公司；熒光定量試劑Power UP SYBR GREEN Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備：電泳儀（DYY-2C）和水平電泳槽（DYCP-31C）購(gòu)自北京六一儀器廠；超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；PCR儀（C1000 TouchTM）、熒光定量PCR儀（Biosens SC710）及凝膠成像系統(tǒng)（Universal HoodⅡ）購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已發(fā)布的牛FABP3基因序列（NM_174313.2）和FABP4基因序列（NM_174314.2），使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)蛋白編碼區(qū)（CDS）序列擴(kuò)增引物及熒光定量分析特異性引物，篩選綜合得分最高的引物序列，并委托擎科生物科技有限公司合成。

1.3 組織總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol法分別提取犢牛、成年關(guān)嶺牛與雜交牛各組織總RNA，使用超微量分光光度測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度及OD，質(zhì)量合格的RNA置于-80℃冰箱保存。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 FABP3和FABP4基因克隆

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增牛FABP3和FABP4基因CDS序列。PCR反應(yīng)體系10.0μL：cDNA模板0.4μL，正、反向引物（10μmol/L）各0.4μL，2×TaqPCR StarMix 5.0μL，ddH2O 3.8μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s/kb，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物后連接至pMD19-T載體，然后在16℃下轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，取樣涂抹至固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)；經(jīng)氨芐青霉素篩選后挑選單個(gè)菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)繁，菌液PCR鑒定呈陽(yáng)性的質(zhì)粒送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 FABP3和FABP4基因CDS序列生物信息學(xué)分析

使用ProtScale（https：//www.expasy.org/）和Prot-Param（https：//web.expasy.org/protscale/）分別分析FABP3、FABP4蛋白疏水性及其理化性質(zhì)，采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html%5D）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）分別預(yù)測(cè)2個(gè)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用TMHMM-2.0、SignalP-5.0及NetPhos-3.1分別預(yù)測(cè)分析FABP3、FABP4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)，利用STRING（https：//string-db.org/）預(yù)測(cè)FABP3和FABP4蛋白的相互作用蛋白，并以MegAlign和MEGA 7.0分別進(jìn)行FABP3、FABP4氨基酸序列同源比對(duì)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FABP3和FABP4基因表達(dá)

篩選出實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性擴(kuò)增引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)犢牛、成年關(guān)嶺牛及雜交牛各組織中的FABP3和FABP4基因表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：Power UP SYBR GREEN Master Mix 5.0μL，正、反向引物（10μmol/L）0.4μL，cDNA模板0.5μL，滅菌水3.7μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃15 s，56℃15 s，72℃60 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因CDS序列擴(kuò)增結(jié)果

以犢牛背最長(zhǎng)肌cDNA為模板擴(kuò)增FABP3和FABP4基因CDS序列，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示分別擴(kuò)增出435 bp（圖1-A）和433 bp（圖1-B）的清晰條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，可進(jìn)行下一步研究。

2.2 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因克隆及測(cè)序結(jié)果

經(jīng)菌液PCR鑒定呈陽(yáng)性的質(zhì)粒送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI已發(fā)布的牛FABP3和FABP4基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛FABP3基因CDS序列第324位核苷酸（圖2-A）存在堿基突變（G→A），為同義突變，氨基酸不發(fā)生改變；FABP4基因CDS序列第220和327位核苷酸（圖2-B）存在堿基突變（A→G和A→G），致使甲硫氨酸和異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第348和396位存在堿基同義突變（G→C和A→G），氨基酸不發(fā)生改變。

2.3 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果ProtParam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛FABP3基因CDS序列全長(zhǎng)402 bp，共編碼133個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子式為C654H1054N174O204S5，原子數(shù)為2091，分子量為14778.91 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.73；含量最高的氨基酸為蘇氨酸（占13.5%），含量最低的氨基酸是半胱氨酸和脯氨酸，各占0.8%；蛋白不穩(wěn)定指數(shù)10.51，為穩(wěn)定蛋白。FABP4基因CDS序列全長(zhǎng)399 bp，共編碼132個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子式為C645H1041N171O201S7，原子數(shù)為2065，分子量為14631.81 Da，pI為5.52；同樣以纈氨酸含量最高（占12.9%），半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸和酪氨酸的含量均較低，各占1.5%；蛋白不穩(wěn)定指數(shù)12.68，為穩(wěn)定蛋白。ProtScale預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP3蛋白第114位亮氨酸疏水性最強(qiáng)（1.289）、第76位丙氨酸親水性最強(qiáng)（-2.444），親水性總體平均值為-0.247，屬于親水性蛋白（圖3-A）；FABP4蛋白第46位天冬酰胺疏水性最強(qiáng)（1.789）、第76位脯氨酸親水性最強(qiáng)（-2.278），親水性總體平均值為-0.183，屬于親水性蛋白（圖3-B）。

2.3.2 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)結(jié)果通過SOMPA預(yù)測(cè)得知，F(xiàn)ABP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種結(jié)構(gòu)構(gòu)成（圖4-A），其中延伸鏈占36.09%、無(wú)規(guī)則卷曲占30.83%、α-螺旋占23.31%、β-轉(zhuǎn)角占9.77%；FABP4蛋白同樣由4種結(jié)構(gòu)組成（圖4-B），其中占比最高的也是延伸鏈（占37.12%），無(wú)規(guī)則卷曲占31.06%、α-螺旋占21.21%、β-轉(zhuǎn)角占10.61%。通過SWISS-MODEL預(yù)測(cè)關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)二者的延伸鏈占比較高，同時(shí)富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.3.3 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果通過TMHMM-2.0和SignalP-5.0分別預(yù)測(cè)關(guān)嶺牛FABP3、FABP4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽，結(jié)果（圖6和圖7）顯示二者均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。NetPhos-3.1預(yù)測(cè)顯示，關(guān)嶺牛FABP3蛋白存在26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括6個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、18個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖8-A）；關(guān)嶺牛FABP4蛋白存在21個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括8個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖8-B）。

2.3.4 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4蛋白的互作蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果使用STRING對(duì)關(guān)嶺牛FABP3、FABP4蛋白的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明二者與FABP1、FABP6、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（LPL）及激素敏感脂肪酶（LIPE）等存在互作關(guān)系（圖9）。其中，F(xiàn)ABP1和FABP6共屬于FABPs家族成員，F(xiàn)ABP1主要在肝臟內(nèi)發(fā)揮作用，與細(xì)胞質(zhì)中的游離脂肪酸及其輔酶A衍生物共同參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；FABP6可結(jié)合膽汁酸并參與腸肝膽汁酸代謝，是脂肪酸代謝過程中的關(guān)鍵因子（Xu et al.，2019）。PPARγ調(diào)控脂肪酸的過氧化物酶體β-氧化途徑，是脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Janani and Ranjitha，2015）；在硬骨魚類中，PPARγ參與FABPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并與FABPs家族蛋白協(xié)同調(diào)控細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝（Venkatachalam et al.，2017）。LIPE主要功能是將儲(chǔ)存的甘油三酯水解為游離脂肪酸，還可將膽固醇酯轉(zhuǎn)化為游離膽固醇以產(chǎn)生類固醇激素，對(duì)脂肪沉積至關(guān)重要（Goszczynski et al.，2014）。LPL則是甘油三酯降解的限速酶，參與各種脂蛋白代謝，是調(diào)控脂肪代謝的關(guān)鍵酶之一（王晶等，2013）。

2.4 FABP3和FABP4氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果

使用MegAlign對(duì)不同物種的FABP3和FABP4氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示，關(guān)嶺牛與牦牛、綿羊、馬、人類、小鼠、大鼠、斑馬魚、豬、雞的FABP3氨基酸序列相似性分別為100.0%、96.2%、91.0%、24.1%、85.7%、85.7%、69.9%、92.5%和78.2%，其中與人類的相似性最低（圖10-A）；關(guān)嶺牛與牦牛、綿羊、馬、人類、小鼠、大鼠、斑馬魚、豬、雞的FABP4氨基酸序列相似性分別為97.7%、93.2%、78.8%、84.1%、85.6%、83.3%、26.5%、81.8%和72.0%，其中與斑馬魚的相似性最低（圖10-B）。基于FABP3和FABP4氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖11）均顯示，關(guān)嶺牛與牦牛的親緣關(guān)系最近，其次是綿羊，與雞和斑馬魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 FABP3和FABP4基因在犢牛、成年關(guān)嶺牛及雜交牛不同組織中的表達(dá)規(guī)律

2.5.1 關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物退火溫度的確定根據(jù)引物合成報(bào)告，選擇關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物退火溫度范圍，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶明亮單一（圖12），最終確定關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物最佳退火溫度分別為59和56℃。

2.5.2FABP3基因在犢牛、成年關(guān)嶺牛和雜交牛不同組織中的表達(dá)情況FABP3基因在犢牛、成年關(guān)嶺牛和雜交牛不同組織中均有表達(dá)，且以心臟的相對(duì)表達(dá)量最高（圖13），具體表現(xiàn)：FABP3基因在犢牛中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)樾呐K＞腎臟＞小腸＞脾臟＞背最長(zhǎng)肌＞肝臟＞脂肪＞肺臟，在心臟、腎臟、小腸、脾臟和背最長(zhǎng)肌間的相對(duì)表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01，下同），且均極顯著高于其他組織中的相對(duì)表達(dá)量；FABP3基因在成年牛中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)樾呐K＞脂肪＞脾臟＞小腸＞肺臟＞腎臟＞背最長(zhǎng)?。靖闻K，以心臟、脂肪和脾臟的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織；FABP3基因在雜交牛中的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)樾呐K＞脂肪＞脾臟＞腎臟＞小腸＞肝臟＞背最長(zhǎng)?。痉闻K，其中心臟和脂肪的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織。在不同年齡段關(guān)嶺牛中，F(xiàn)ABP3基因在成年牛心臟、脾臟、脂肪、肝臟和肺臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著或顯著（P＜0.05，下同）高于犢牛（圖14-A）。此外，F(xiàn)ABP3基因在成年牛心臟、肺臟和背最長(zhǎng)肌中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于雜交牛，而在肝臟和腎臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于雜交牛（圖14-B）。

2.5.3FABP4基因在犢牛、成年關(guān)嶺牛和雜交牛不同組織中的表達(dá)情況FABP4基因在犢牛、成年牛和雜交牛的不同組織中均有表達(dá)，在脂肪中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，而在其他組織間的相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著（P＜0.05，下同）（圖15）。在不同年齡階段關(guān)嶺牛中，F(xiàn)ABP4基因在犢牛腎臟、背最長(zhǎng)肌和脂肪中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于成年牛，在心臟、肝臟、肺臟和小腸則表現(xiàn)為極顯著或顯著低于成年牛（圖16-A）。此外，F(xiàn)ABP4基因在成年牛心臟、肝臟和脾臟中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于雜交牛，但在脂肪中的相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著差異（圖16-B）。

3 討論

FABPs是細(xì)胞中重要的脂肪酸載體蛋白，對(duì)脂肪酸的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝起重要調(diào)控作用（Furuhashi and Hotamisligil，2008）。FABP3在心肌和骨骼肌細(xì)胞中高度表達(dá)可引導(dǎo)脂肪酸進(jìn)行β氧化，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞葡萄糖氧化增強(qiáng)及血漿脂肪酸水平升高（Smathers and Petersen，2011）。已有研究表明，過表達(dá)FABP3基因能觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，啟動(dòng)與心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及重塑相關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致缺血性心臟損傷（Zhuang et al.，2019）。FABP4基因主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，已廣泛用作脂肪細(xì)胞成熟的標(biāo)志（Furuhashi，2019）。此外，F(xiàn)ABP4在能量循環(huán)中發(fā)揮著整合脂肪能量?jī)?chǔ)存及運(yùn)輸?shù)淖饔茫≒rentice et al.，2019）。近年來，有關(guān)FABP3和FABP4基因的研究主要與人類疾病及其免疫相關(guān)，在家畜上尤其是針對(duì)牛FABP3和FABP4基因的研究鮮見報(bào)道。

本研究成功克隆獲得關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因CDS序列，與NCBI已公布的對(duì)應(yīng)序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因序列僅存在1個(gè)突變位點(diǎn)，且為同義突變不改變氨基酸序列，表明該基因在關(guān)嶺牛上遺傳較穩(wěn)定；FABP4基因序列存在4個(gè)突變位點(diǎn)，有2個(gè)突變位點(diǎn)會(huì)引起氨基酸序列發(fā)生變化，而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中無(wú)規(guī)則卷曲占比由23.48%提高到31.06%。無(wú)規(guī)則卷曲是蛋白肽鏈中與配體和受體結(jié)合的重要部分（趙采芹等，2022），F(xiàn)ABP4蛋白中的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)變化可能會(huì)影響其與脂肪酸的結(jié)合活性。FABP3和FABP4蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，但這2種蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，故推測(cè)不是分泌蛋白。FABP3和FABP4氨基酸序列同源比對(duì)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，關(guān)嶺牛與牦牛、綿羊和豬的FABP3氨基酸序列相似性較高，除了與人類和斑馬魚的相似性較低外，與其他物種的相似性均在78.2%以上；關(guān)嶺牛與牦牛、綿羊和小鼠的FABP4氨基酸序列相似性較高，除了與斑馬魚的相似性較低外，與其他物種的同源性均在72.0%以上?？梢?，關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因具有較高的遺傳保守性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)ABP3和FABP4基因在關(guān)嶺牛和雜交牛各組織中均有不同程度的表達(dá)，F(xiàn)ABP3基因以在心臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，與Li等（2016）、姚毅等（2017）、胡江等（2019）的研究結(jié)果相似。陳志輝等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在未成熟的動(dòng)物肌肉組織中表達(dá)量較低或不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞開始以脂肪酸作為能源物質(zhì)時(shí)其表達(dá)量才不斷提高。本研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在成年關(guān)嶺牛多個(gè)組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟和脂肪）中的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著高于關(guān)嶺犢牛，但具體原理有待進(jìn)一步探究。FABP3基因在成年關(guān)嶺牛多個(gè)組織（心臟、脾臟、肺臟、背最長(zhǎng)肌和小腸）中的相對(duì)表達(dá)量也顯著或極顯著高于雜交牛，表明FABP3基因?qū)﹃P(guān)嶺牛的影響大于雜交牛。FABP4基因以關(guān)嶺牛脂肪中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織，與Soliman等（2007）、Li等（2015）、劉可可等（2022）的研究結(jié)果一致。FABP4基因在關(guān)嶺犢牛脂肪中的表達(dá)量極顯著高于成年關(guān)嶺牛，與李文娟等（2006）、屠云潔等（2010）的研究結(jié)果恰好相反，可能是物種差異所致。此外，F(xiàn)ABP3基因在成年關(guān)嶺牛和雜交牛的脂肪中也有較高表達(dá)，故推測(cè)其與FABP4基因協(xié)同調(diào)控脂肪細(xì)胞中的脂肪酸代謝。綜上所述，F(xiàn)ABP3和FABP4基因在關(guān)嶺牛和雜交牛各組織中均呈組織特異性表達(dá)，且與脂肪酸代謝密切相關(guān)。

4 結(jié)論

關(guān)嶺牛FABP3和FABP4基因具有較高的遺傳保守性，且以在心臟和脂肪中的表達(dá)水平較高，與脂肪酸代謝密切相關(guān)。