液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中的應用前景①

孫娟　張援　陳穎　官凌菊　趙君軍　高照（廣東省體育科學研究所　廣東廣州　510663）

液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中的應用前景①

孫娟張援陳穎官凌菊趙君軍高照
（廣東省體育科學研究所廣東廣州510663）

摘 要：運動性疲勞是長期困擾運動員的一個棘手問題，運動性中樞疲勞與神經(jīng)遞質的關系已成為體育科研人員研究的一個熱點。對運動性中樞疲勞與神經(jīng)遞質的關系、液質聯(lián)用技術在神經(jīng)遞質檢測方面的應用以及液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中較其他檢測技術的優(yōu)越性進行綜述，顯示液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中有著廣泛的應用前景，促進對運動性中樞疲勞機制的認識和理解，以期為保障運動員處于最佳運動狀態(tài)提供可靠的檢測手段和科學的依據(jù)。

運動性疲勞一直都是運動訓練學、運動生理學界研究的熱點和難點。隨著現(xiàn)代體育競技水平的提高，訓練強度越來越大，這種極限化訓練模式必然給機體帶來最大限度的疲勞[1]。如何有效地預防運動性疲勞的發(fā)生和促進疲勞的恢復，增強運動能力，確保運動員在比賽中保持最佳的競技狀態(tài)，一直是體育科學界所面臨的一大難題。運動性疲勞分為外周疲勞和中樞疲勞，中樞疲勞被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護性抑制，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內神經(jīng)遞質的改變有關。運動性中樞疲勞是由長期的訓練負荷、比賽和非訓練應激因素與機體恢復不平衡等引起的[2]。近年來，隨著腦科學和神經(jīng)生物學的發(fā)展及新技術的應用，使運動性中樞疲勞機制的研究獲得突破性進展，而運動性中樞疲勞的機制研究主要圍繞著腦內神經(jīng)遞質的變化展開。

液相-質譜聯(lián)用技術（Chromatography-MassSpectrometry）是20世紀90年代發(fā)展起來的一種綜合分析技術，將液相色譜（LC）對復雜樣品的高分離能力，與質譜（MS）的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與特征結構信息等優(yōu)點結合起來，形成了較完美的現(xiàn)代分析技術。液質聯(lián)用技術為神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物的定性鑒別和定量檢測提供了一個高效、可靠的分析方法，利用該技術檢測神經(jīng)遞質進行運動性中樞疲勞機制的研究也將成為未來的發(fā)展趨勢。

1　運動性中樞疲勞與神經(jīng)遞質

神經(jīng)遞質是由神經(jīng)細胞分泌并作為一種信使作用于效應細胞，使其發(fā)生特定功能改變的一類神經(jīng)活性物質，廣泛分布于哺乳動物和人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦組織和體液中，是神經(jīng)調節(jié)和內分泌調節(jié)的信使，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的敏感性物質，與運動性中樞疲勞有著密切的關系。目前發(fā)現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要有氨基酸類、單胺類、膽堿類、肽類及嘌呤類神經(jīng)遞質[3]，現(xiàn)在研究者對運動性中樞疲勞機制的研究多集中在單胺類和氨基酸類兩類神經(jīng)遞質。

1.1單胺類神經(jīng)遞質與運動性中樞疲勞

單胺類神經(jīng)遞質在運動過程中有著非常重要的作用，它們與運動能力的提高、機體協(xié)調性的保持緊密相關，并且也是運動性疲勞重要的中樞機制之一[4]。單胺類神經(jīng)遞質是含有芳乙胺結構的神經(jīng)遞質和神經(jīng)調質，主要包括：多巴胺（dopamine DA）、腎上腺素（adrenaline Ad）、去甲腎上腺素（nor epinephrine NE）、5-羥色胺（5-HT）。通常人們又把多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素統(tǒng)稱為兒茶酚胺（catecholamine CA），而把5-羥色胺稱為血清素[5]。

有關單胺類神經(jīng)遞質與運動性中樞疲勞之間的關系已有大量的研究，一次性運動及其恢復期，腦內單胺類神經(jīng)遞質的含量都會發(fā)生一定的變化，而且它們之間的比值也可以用來評價運動性中樞疲勞。Newsholme[6]等首次提出了5-HT可能是中樞疲勞的調節(jié)物質，可以潛在的調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疲勞程度，他們的研究發(fā)現(xiàn)腦內5-HT濃度在長時間的運動后會升高，影響機體的其他調節(jié)作用，從而導致運動性中樞疲勞的發(fā)生，其中下丘腦和腦干部位的5-HT升高最為明顯。趙麗等[7]通過測定一次力竭運動小鼠中樞單胺類神經(jīng)遞質去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）及其代謝產(chǎn)物多巴克（DOPAC）、5羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）含量的變化，以期為運動疲勞的中樞機制提供一定實驗室依據(jù)。力竭時海馬、皮層和腦干NE含量較安靜時明顯增加，而紋狀體、下丘腦和小腦NE含量有降低趨勢。海馬、腦干組織中DA含量力竭時極顯著地增加，皮層、紋狀體區(qū)僅有增加趨勢，而下丘腦DA含量較安靜時則有降低趨勢；DA的代謝產(chǎn)物DOPAC僅在腦干有明顯增加。各個腦區(qū)力竭時5-HT均較安靜時明顯增加，其代謝產(chǎn)物5-HIAA在皮層、下丘腦及小腦也顯著增加。候莉娟等[8]通過測定大鼠紋狀體單胺類神經(jīng)遞質及多巴胺神經(jīng)遞質及其受體表達量在運動疲勞前后的變化，探討紋狀體多巴胺系統(tǒng)信號通路在運動疲勞后中樞調節(jié)中的作用，運動疲勞使大鼠紋狀體區(qū)5-羥色胺、多巴胺與多巴胺Ⅱ型受體含量顯著增高，多巴胺可能與Ⅱ型受體結合激活間接通路，影響錐體外系對運動功能的調節(jié)。

1.2氨基酸類神經(jīng)遞質與運動性中樞疲勞

氨基酸類神經(jīng)遞質可分為兩類：一類為抑制性氨基酸遞質，包括甘氨酸（Gly）、?-氨基丁酸（GABA），這類遞質是中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)保護性抑制的重要因素之一，因此它們在調節(jié)機體的興奮狀態(tài)、協(xié)調運動中樞的功能活動中發(fā)揮重要作用。另一類為興奮性氨基酸遞質，包括谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），谷氨酸在谷氧酸脫羧酶的催化作用下脫羧生成?-氨基丁酸（GABA），兩者的代謝在正常生理條件下處于相對平衡狀態(tài)。Glu和Asp含量的下降說明中樞系統(tǒng)興奮性降低，原因可能是機體在過度疲勞狀態(tài)下產(chǎn)生了抑制性保護，這樣可以減弱興奮性神經(jīng)遞質大量增加對神經(jīng)元產(chǎn)生的毒害作用，還可以防止運動過程中機體代謝產(chǎn)物對中樞系統(tǒng)正常功能的影響[9]。

氨基酸類神經(jīng)遞質總量是指細胞內、外遞質含量的總和，它反映的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞質合成與釋放的綜合效應[10]。研究表明，機體運動前、后及恢復期，氨基酸類神經(jīng)遞質總量都會發(fā)生一定的變化，腦中GABA含量升高，Glu/GABA比值下降，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮與抑制過程，從而導致運動性中樞疲勞的發(fā)生。季瀏提出[11]，白鼠長時間運動后（10h），大腦中的GABA含量顯著增加，大腦興奮性降低，中樞疲勞產(chǎn)生，表明腦中GABA含量升高引起的中樞抑制過程與長時間運動引起的疲勞密切相關。白寶豐等[12]研究了力竭運動前后大鼠腦皮質運動區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質總量的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)力竭運動后即刻Glu總量有所下降，GABA總量顯著上升至最高點；Gly總量在力竭運動后即刻、恢復0.5h、1h均顯著性高于安靜值，恢復期0.5h達到最高點，同GABA含量變化相比具有時相差異性；Glu/GABA比值在恢復期有所增高，而Glu+Asp/GABA+Gly比值始終低于安靜值。說明大鼠腦皮質運動區(qū)Glu含量下降和GABA含量增高與運動中樞抑制過程密切有關；觀察大鼠腦中Glu+Asp/ GABA+Gly比值變化，反映運動性疲勞時腦的機能狀態(tài)，比Glu/ GABA比值更有意義。還有學者認為Glu/GABA比值變化可以在一定程度上反映腦內氨基酸類神經(jīng)遞質的平衡情況，影響神經(jīng)生理功能的變化，用Glu/GABA比值來觀察運動疲勞時腦的機能狀態(tài)可能比單純觀察GABA意義更大[13-14]。

2　液質聯(lián)用技術在神經(jīng)遞質檢測中的應用

自20世紀90年代成套的液質聯(lián)用儀問世以來，液質聯(lián)用技術已在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保等眾多領域發(fā)揮著不可比擬的作用。近十多年來，隨著LC-MS技術發(fā)展的日臻完善，其在神經(jīng)遞質檢測中的應用也越來越廣泛。如蘇芬麗等[15]建立了LC-MS/MS法同時測定大鼠腦組織中5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥吲哚乙酸、3，4-雙羥苯乙酸（DOPAC）、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇（MHPG）和高香草酸（HVA）7種單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物的含量，可用于神經(jīng)精神疾病神經(jīng)遞質的研究與分析。該方法操作簡單，流動相簡單易配，靈敏度高和特異性好，兩次進樣只需17 min即可完成檢測，因此更適合于臨床科研工作中大批量樣本的檢測。李慧等[16]將大鼠腦海馬組織勻漿后，勻漿液經(jīng)鹽酸正丁醇衍生化反應形成氨基酸丁酯，LC-MS-MS測定海馬組織中氨基酸類神經(jīng)遞質?-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）的含量，在測定上消除干擾物質，而只特異性地檢測以上幾種氨基酸，達到精確定量的目的。張蕾等[17]建立了一種同時測定小鼠腦組織中多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素、5-羥色胺、乙酰膽堿、?-氨基丁酸和谷氨酸7種神經(jīng)遞質含量的LC-MS/MS分析方法，實現(xiàn)了3類神經(jīng)遞質的同時測定，且樣品需要量小、操作簡單；通過動物試驗驗證了所建立的LC-MS/MS分析方法的可靠性，并同時將該方法應用于酸棗果肉鎮(zhèn)靜催眠的藥理作用機制研究。

3　液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中的應用

液質聯(lián)用技術檢測神經(jīng)遞質不僅集中于醫(yī)學領域，在運動醫(yī)學、運動生理生化研究中的應用也較為廣泛。如趙先恩等[18]用1，2-苯并-3，4-二氫咔唑-9-乙基氯甲酸酯作為柱前熒光衍生試劑，高效液相色譜質譜聯(lián)用法測定A、B兩組（A：安靜對照組，B：運動訓練組）4種取樣狀態(tài)（安靜、運動1h、力竭即刻、力竭后恢復12 h）下的64只大鼠端腦組織中5種神經(jīng)遞質（谷氨酸、?-氨基丁酸、多巴胺、5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸）的定量結果，實現(xiàn)了兩種氨基酸類和3種單胺類神經(jīng)遞質的同時完全衍生與檢測。測定結果表明：（1）5-HT運動后的含量變化與疲勞恢復密切相關，是引起中樞疲勞的重要神經(jīng)遞質；長期中等強度的運動訓練能夠促進5-HT的轉化，并能顯著提高大鼠耐力運動后的疲勞恢復能力。（2）長期的運動訓練使大鼠適應了運動應激，力竭運動后B組比A組端腦中DA水平恢復速度明顯。（3）雖然長期運動訓練使大鼠的運動能力提高，但中樞神經(jīng)保護性的抑制能力降低，GABA和GLU水平恢復到安靜狀態(tài)較緩慢。因此得出了長期中等強度的運動訓練能夠有效提高大鼠的運動能力及耐力運動后疲勞恢復能力的結論。劉洪珍等[19]選用8周齡大鼠64只，適應跑臺訓練1周后，隨機分成兩組（服藥組和對照組），服藥組灌服復方中藥煎劑8周。然后，每組再分成4個亞組分別于不同狀態(tài)下斷頭處死，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，采用柱前衍生-高效液相色譜熒光檢測法測定其端腦中5-HT、5-HIAA、DA、GLU和GABA 5種中樞遞質含量，探討復方中藥制劑對運動大鼠中樞神經(jīng)遞質含量的影響，進一步認識中藥提高運動能力和促進運動性疲勞恢復的作用機理。結果表明在大鼠運動至力竭的過程中，復方中藥制劑能明顯抑制5-HIAA、5-HT、DA、GABA的生成和促進GLU中樞遞質的合成，其綜合效應表現(xiàn)為興奮性神經(jīng)遞質相對顯著增多，中樞神經(jīng)興奮性增強、顯著延長大鼠的運動時間和促進中樞疲勞的恢復。

4　液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中的優(yōu)勢

神經(jīng)遞質的檢測方法國內外報道較多的有高效液相色譜檢測法[20]、高效液相色譜-電化學檢測法[21]和高效毛細管電泳-激光誘導熒光檢測法[22]等，但這些方法存在靈敏度欠佳、重現(xiàn)性不穩(wěn)定、樣品前期純化處理耗時耗力等缺點。液質聯(lián)用技術與這些檢測技術相比具有其特有的優(yōu)勢：⑴具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點，非常適合對神經(jīng)遞質進行定量分析。由于運動性中樞疲勞機制復雜，神經(jīng)遞質及其代謝產(chǎn)物的定量分析也越來越傾向于同時測定多種神經(jīng)遞質和同時測定不同類別的多種神經(jīng)遞質；液質聯(lián)用技術采用液相與三重四級桿（LC-MS/MS）聯(lián)用技術，通過選擇離子檢測（SIM）、多反應監(jiān)測（MRM）等模式可以同時定量測定多種神經(jīng)遞質。⑵具有強大的分離及結構鑒定能力。中樞神經(jīng)遞質是一個非常復雜的化學體系，含有大量的次生代謝產(chǎn)物，其結構復雜，性質相似；液質聯(lián)用技術可以分析化合物的結構，有助于對未知化合物進行定性分析，且靈敏度高，可以極大地促進運動性中樞疲勞機制研究。⑶液質聯(lián)用技術可避免復雜、繁瑣、耗時的樣品前處理工作，通過多反應監(jiān)測，大大提高分析的專一性，靈敏度高，重現(xiàn)性好，因此在中樞神經(jīng)遞質的定性與定量研究中顯示出強大的優(yōu)勢。隨著液質聯(lián)用技術的不斷成熟，必將會被更廣泛地應用于運動性中樞疲勞研究中。

5　結語

液質聯(lián)用技術在運動性中樞疲勞研究中的應用，能為進一步

揭示運動性中樞疲勞機制提供有效、可靠的數(shù)據(jù)和方法學支撐，以期為保障運動員處于最佳運動狀態(tài)提供可靠的檢測手段和科學的依據(jù)。同時隨著科學技術的不斷發(fā)展，液質聯(lián)用技術與先進采樣技術的聯(lián)用，解決樣品和檢測這兩個在運動性中樞疲勞研究中至關重要的環(huán)節(jié)，會進一步促進對中樞疲勞機制的認識和理解，尋找行之有效的預防或消除疲勞的方法，液質聯(lián)用技術必將在運動訓練監(jiān)控和疲勞恢復等領域展現(xiàn)出更好的應用前景。

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關鍵詞：液質聯(lián)用技術運動性中樞疲勞神經(jīng)遞質檢測

LC-MS Technique in Exercise-induced Central Fatigue Research

Sun JuanZhang YuanChen YingGuan LingjuZhao JunjunGao Zhao
（Guangdong Provincial Research Institute of Sports Science，Guangzhou Guangdong510663，China）

Abstract：Exercise fatigue is a thorny problem has long plagued the？athletes.The relationship between exercise-induced central fatigue and neurotransmitters has become a hot research in？sports scientific.The present review involved the relationship between exerciseinduced central fatigue and neurotransmitters，LC-MS technique application in the detection of neurotransmitter and the LC-MS technique superiority in the study of exercise-induced central fatigue in comparison with other detection techniques.It was shown that LC-MS technique has a broad application prospects in the study of exercise-induced central fatigue so as to promote awareness and understanding of the mechanism of exercise-induced fatigue， in order to provide a reliable detection methods and scientific basis to ensure the athletes in the best state of motion.

Keywords：LC-MS technique；Exercise-induced central fatigue；Neurotransmitters；Detection

作者簡介：①孫娟（1981—），女，碩士，助理研究員，主要研究方向為運動生理生化。

中圖分類號：G8

文獻標識碼：A

文章編號：2095-2813（2015）06（a）-0008-03