miR-138靶向調(diào)控FAK抑制三陰型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制

王棧山，譚 勝，駱廣濤，王本忠

三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是指ER、PR、HER-2均陰性的乳腺癌亞型[1]。MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中，由19～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA[2-3]。已往研究表明，miR-138在肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，提示miR-138作為抑癌基因可能為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)[4-6]。然而，目前關(guān)于miR-138在TNBC中的生物學(xué)功能及其下游調(diào)控機(jī)制研究較少。本研究擬選取人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231作為研究對(duì)象，初步探討miR-138在TNBC侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，并通過(guò)生物信息學(xué)以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討miR-138的下游靶基因及其具體調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要實(shí)驗(yàn)試劑MDA-MB-231細(xì)胞株由本課題組長(zhǎng)期保存，細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司；Trizol購(gòu)于Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)于Corning公司，Matrigel膠購(gòu)于BD公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)于ABI公司；DNA小抽及中抽試劑盒購(gòu)于Axygen公司；miR-138 mimics、miR-138 mimics NC、miR-138 Inhibitor、miR-138 Inhibitor NC、FAK siRNA及FAK siRNA NC購(gòu)于銳博公司；Western blot蛋白Marker購(gòu)于Thermo Scientific公司；β-Actin抗體購(gòu)于Abcam公司；FAK抗體、兔二抗和鼠二抗購(gòu)于CST公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細(xì)胞置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)2～3日傳代1次。

1.2.2Real-time PCR 首先運(yùn)用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA。Real-time PCR使用SYBR Green PCR Master Mixture檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-138的相對(duì)表達(dá)量，用U6作為內(nèi)參，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。miR-138引物序列：正向5′-GCCGCAGCTGGTGTTGTGAATCA-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Real-time PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算樣品miR-138的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 非Matrigel膠覆蓋和Matrigel膠覆蓋的Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力。MDA-MB-231細(xì)胞消化、離心并棄去培養(yǎng)基，使用不含血清的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至4×108/L。下室加入600 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基，24～48 h后棄去下室培養(yǎng)基，90%乙醇室溫固定30 min。晾干后使用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。用潔凈棉簽擦掉上室未穿過(guò)孔膜的細(xì)胞，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)需鋪Matrigel膠，其余實(shí)驗(yàn)步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)一致。

1.2.4miR-138下游靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)TargetScan、PicTar和miRanda三個(gè)miRNA靶基因在線預(yù)測(cè)工具共同預(yù)測(cè)miR-138的下游靶基因。使用這三種預(yù)測(cè)工具得到miR-138下游靶基因列表后，繪制Venn圖，取列表交集并通過(guò)文獻(xiàn)檢索等方法篩選miR-138的下游靶基因。

1.2.5Western blot 使用Western blot技術(shù)檢測(cè)FAK蛋白表達(dá)，內(nèi)參蛋白為β-Actin。首先進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。用移液槍將蛋白樣品緩慢加入到膠孔內(nèi)。設(shè)置起始電壓為100 V，待蛋白樣品在濃縮膠壓縮呈一條直線后，改電壓為150 V。電泳終止后，卸下膠板并組裝“三明治”轉(zhuǎn)膜裝置開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用5%脫脂牛奶常溫?fù)u床封閉1 h。封閉結(jié)束用TBS洗滌1次，4 ℃搖床用一抗(FAK 1 ∶1 000，β-Actin 1 ∶2 000)孵育過(guò)夜。第2天回收一抗，TBS洗10 min，共3次。常溫?fù)u床用二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，TBS洗10 min，共3次。顯影并保存曝光結(jié)果。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 在NCBI下載人FAK基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物并擴(kuò)增FAK 3’UTR。將FAK 3’UTR序列插入到psiCHECK2質(zhì)粒構(gòu)建psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)。同時(shí)將FAK 3’UTR上miR-138相應(yīng)識(shí)別位點(diǎn)突變后插入到psiCHECK2質(zhì)粒中構(gòu)建突變質(zhì)粒psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)。構(gòu)建的FAK 3’UTR野生型質(zhì)?；蛲蛔冃唾|(zhì)粒在MDA-MB-231細(xì)胞分別與miR-138 mimics或miR-138 mimics NC共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)具體分組見表1。共轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液，置于搖床避光低速孵育20 min。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管，置于冰上。檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分組

1.2.7實(shí)驗(yàn)分組 miR-138過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組：MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-138 mimics(miR-138組)及其陰性對(duì)照miR-138 mimics NC(NC組)。miR-138功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ及回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ，具體分組如表2所示。

表2 miR-138功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)分組

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)miR-138后MDA-MB-231細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變?yōu)轵?yàn)證miR-138 mimics的過(guò)表達(dá)效率，本組應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-138 mimics及miR-138 mimics NC后miR-138的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-138組miR-138的表達(dá)量上調(diào)了約30倍(P<0.01，圖1)。

圖1 MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-138 mimics及陰性對(duì)照后miR-138表達(dá)變化

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-138組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力降低(P<0.01，圖2)；此外，miR-138組細(xì)胞侵襲能力亦較NC組降低(P<0.01，圖2)。上述結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-138可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

圖2 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-138 mimics及陰性對(duì)照后遷移和侵襲能力的改變

2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-138下游靶基因使用TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預(yù)測(cè)工具得到miR-138下游靶基因列表，繪制Venn圖，取列表交集發(fā)現(xiàn)有58個(gè)基因在三種預(yù)測(cè)工具中均是miR-138的靶基因(圖3A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這58個(gè)靶基因中FAK基因3’UTR存在miR-138的結(jié)合位點(diǎn)，且該結(jié)合位點(diǎn)在包括智人、黑猩猩等多個(gè)物種中高度保守(圖3B、C)。綜上生物信息學(xué)結(jié)果表明：FAK可能是miR-138的下游靶基因。

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-138的下游靶基因：A.TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測(cè)miR-138下游基因的Venn圖；B.FAK 3’UTR上miR-138的識(shí)別位點(diǎn)位于其3’UTR的56～63處，在智人(H.Sapiens)、黑猩猩(P.Troglodytes)、恒河猴(M. mulatta)、家鼠(M. musculus)及褐鼠(R. norvegicus)等物種中高度保守；C. FAK 3’UTR上miR-138的識(shí)別位點(diǎn)及FAK 3’UTR的突變位點(diǎn)

2.3 驗(yàn)證miR-138與下游靶基因FAK的靶向關(guān)系本組構(gòu)建psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)及psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)質(zhì)粒，突變位點(diǎn)見圖3C。使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot驗(yàn)證miR-138與FAK基因的靶向關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與野生型對(duì)照組相比，野生型處理組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01，圖4A)；突變型處理組熒光素酶活性較突變型對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，miR-138 mimics組FAK蛋白表達(dá)量顯著降低(圖4B)。上述結(jié)果證實(shí)FAK是miR-138的下游靶基因。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot驗(yàn)證miR-138與FAK基因的靶向關(guān)系：A.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-138結(jié)合FAK 3’UTR熒光素酶活性：WT 3’UTR. psiCHECK2-FAK 3’UTR(野生型)；MUT 3’UTR. psiCHECK2-MUT-FAK 3’UTR(突變型)；B.Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-138后FAK蛋白表達(dá)變化

2.4 miR-138通過(guò)調(diào)控FAK表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，miR-138處理組FAK蛋白表達(dá)量下調(diào)(圖5A)；與miR-138處理組相比，回復(fù)組FAK蛋白表達(dá)量上調(diào)(圖5A)。Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，miR-138處理組細(xì)胞的遷移與侵襲能力均降低(P<0.01，圖5B、C)；與miR-138處理組相比，回復(fù)組細(xì)胞的遷移與侵襲能力均增強(qiáng)(P<0.01，圖5B、C)。上述結(jié)果表明上調(diào)FAK可以部分恢復(fù)miR-138過(guò)表達(dá)所抑制的細(xì)胞遷移與侵襲能力。

圖5 上調(diào)FAK對(duì)miR-138過(guò)表達(dá)所抑制的細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響(回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ)：A.Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組FAK蛋白表達(dá)改變；B.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)；C.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)；對(duì)照組：miR-138 mimics NC+Vec共轉(zhuǎn)染組(NC+Vec)；miR-138處理組：miR-138 mimics+Vec共轉(zhuǎn)染組(miR-138+Vec)；回復(fù)組：miR-138 mimics+FAK共轉(zhuǎn)染組(miR-138+FAK)

回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，miR-138處理組FAK蛋白表達(dá)量上調(diào)(圖6A)；與miR-138處理組相比，回復(fù)組FAK蛋白表達(dá)量下調(diào)(圖6A)。Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，miR-138處理組細(xì)胞的遷移與侵襲能力均顯著增強(qiáng)(P<0.05，圖6B、C)；與miR-138處理組相比，回復(fù)組細(xì)胞的遷移與侵襲能力均顯著降低(P<0.05，圖6B、C)。上述結(jié)果表明，使用FAK siRNA敲低FAK可以部分回復(fù)miR-138抑制所增強(qiáng)的細(xì)胞遷移與侵襲能力。

圖6 敲低FAK對(duì)miR-138抑制所增強(qiáng)的細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響(回復(fù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ)：A.Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組FAK蛋白表達(dá)改變；B.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)目；C.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞各轉(zhuǎn)染組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目；對(duì)照組：miR-138 Inhibitor NC+FAK siRNA NC共轉(zhuǎn)染組(Inhibitor NC+siNC)；miR-138處理組：miR-138 Inhibitor+FAK siRNA NC共轉(zhuǎn)染組(miR-138 In+siNC)；回復(fù)組：miR-138 Inhibitor+FAK siRNA共轉(zhuǎn)染組(miR-138 In+siFAK)

3 討論

目前,乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[7]。近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率逐年上升，根據(jù)最新研究統(tǒng)計(jì)，乳腺癌每年新發(fā)病例約占所有女性新發(fā)腫瘤的25%[8]。TNBC作為乳腺癌惡性程度最高的分子亞型，對(duì)內(nèi)分泌治療及靶向治療均不敏感，具有侵襲性強(qiáng)，早期易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，臨床治療預(yù)后極差。有研究表明伴復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的TNBC患者總體生存期(overall survival, OS)僅為13～18個(gè)月[9]。深入探究TNBC的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，可為TNBC患者治療策略的選擇和預(yù)后判斷提供新思路。

多種惡性腫瘤的miRNA表達(dá)譜發(fā)生特征性改變，導(dǎo)致其調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)異常，從而賦予腫瘤細(xì)胞諸如無(wú)限增殖、凋亡抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移及放化療抵抗等惡性表型。有研究表明miR-138在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[10]。此前，本課題組檢測(cè)了14例正常乳腺組織和21例乳腺癌組織中miR-138的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：相較于正常乳腺組織，乳腺癌組織中miR-138表達(dá)量顯著下調(diào)(本文未顯示相關(guān)數(shù)據(jù))。為探討miR-138對(duì)TNBC侵襲、轉(zhuǎn)移功能的影響，本課題組選擇了高轉(zhuǎn)移潛能的TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231開展本實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)miR-138后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著降低，表明miR-138可能在TNBC中發(fā)揮抑癌基因作用，這與既往報(bào)道的miR-138在腫瘤中的功能相一致[4-6]。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，在結(jié)直腸癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)[11]。此前研究表明，F(xiàn)AK可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞黏附、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，是腫瘤惡性進(jìn)展的重要調(diào)控因子[11]。此外，F(xiàn)AK還參與整合素依賴性信號(hào)通路，介導(dǎo)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的串?dāng)_反應(yīng)(crosstalk)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預(yù)測(cè)工具均預(yù)測(cè)FAK可能是miR-138潛在的靶標(biāo)基因。本實(shí)驗(yàn)挑選FAK作為下一步的研究基因是因?yàn)椋?1)FAK在乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高[11]；(2)FAK與乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]；(3)包括miR-1224在內(nèi)的若干miRNAs能調(diào)控FAK表達(dá)抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[13]。本課題組采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot法證實(shí)FAK是miR-138的下游靶基因，并進(jìn)一步通過(guò)回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在TNBC細(xì)胞中miR-138通過(guò)調(diào)控FAK發(fā)揮其生物學(xué)功能。

越來(lái)越多的研究表明：FAK可通過(guò)調(diào)控特定靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路“馴化”腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[14-16]。Rath等[15]發(fā)現(xiàn)FAK上調(diào)是導(dǎo)致胰腺癌纖維化和免疫耐受微環(huán)境形成的重要原因。Serrels等[16]證實(shí)FAK可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β和CCL5的表達(dá)量，增加腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷力。近期一項(xiàng)研究表明：FAK通過(guò)調(diào)控外泌體miRNAs表達(dá)譜，在乳腺癌轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[17]。外泌體是由腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞及T細(xì)胞等多種細(xì)胞在胞吞過(guò)程中產(chǎn)生的直徑30～150 nm的膜性囊泡[18-19]，是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化，極化后的巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌TGF-β、IL-10等促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[20]。外泌體作為體內(nèi)跨越不同生物屏障進(jìn)行藥物傳遞的有效工具，除作為化療藥物理想的載體外，對(duì)siRNA及miRNA等人工合成的核酸類物質(zhì)也有非常好的傳遞作用。理論上，通過(guò)外泌體外源性導(dǎo)入miR-138能通過(guò)調(diào)控其下游靶基因FAK抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。截至目前，人們對(duì)外泌體miRNAs及FAK在腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)制以及相關(guān)信號(hào)通路方面的研究尚淺?，F(xiàn)階段外泌體釋放、靶向運(yùn)輸機(jī)制尚未完全闡明，外泌體的人工修飾技術(shù)亦未完全成熟。倘若在未來(lái)能夠攻克這些外泌體的理論和技術(shù)難題，通過(guò)外泌體導(dǎo)入miR-138可能會(huì)成為一種新的TNBC靶向治療方案。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-138通過(guò)靶向調(diào)控FAK抑制TNBC的侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究?jī)H初步探討了miR-138在TNBC中的功能，仍有諸多難題亟待解決。如miR-138對(duì)體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響如何，miR-138在TNBC細(xì)胞是否存在其他下游靶基因，miR-138在TNBC分泌的外泌體中表達(dá)是否存在差異以及差異表達(dá)的外泌體miR-138是否影響TNBC的侵襲、轉(zhuǎn)移，高選擇性FAK抑制劑如CT-707[21]、VS-6063[22]及BI 853520[23]等是否能抑制TNBC的惡性進(jìn)展。本課題組將對(duì)以上問(wèn)題開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)以探明內(nèi)在關(guān)系。