基于HS—SPME的超聲波輔助提取香椿揮發(fā)性成分工藝優(yōu)化

楊慧+王趙改+史冠瑩+梁萬平+王曉敏+張樂

摘 ? ?要：以中牟棚栽紅油香椿嫩芽為試驗(yàn)材料，基于頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME），采用單因素分析結(jié)合正交試驗(yàn)對超聲波輔助萃取香椿風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，并對萃取物揮發(fā)性成分進(jìn)行分析研究。結(jié)果表明，在頂空固相微萃取最優(yōu)條件為萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min的基礎(chǔ)上，超聲波輔助乙醚法最佳條件為：料液比1∶2，萃取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)3次。風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果顯示，超聲波輔助聯(lián)合頂空固相微萃取法（HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5）檢測出風(fēng)味物質(zhì)69種，比HS-SPME法多6種;HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的為芳香族/烴類物質(zhì)（41.83%）和萜烯類物質(zhì)（22.10%），HS-SPME法則是醛類物質(zhì)（34.57%）、萜烯類物質(zhì)（21.88%）和噻吩類物質(zhì)（12.75%）。

關(guān)鍵詞：香椿;頂空固相微萃取;超聲波

中圖分類號：S644.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.013

Process Optimization of Extracting Toona sinensis Volatiles based on HS-SPME and Ultrasonic-Assisted

YANG Hui1， WANG Zhao-gai1， SHI Guan-ying1， LIANG Wan-ping2， WANG Xiao-min1， ZHANG Le1

（1.Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450008， China; 2. Institute of Resources and Environment， Zhumadian Academy of Agricultural Sciences， Zhumadian， Henan 463000， China）

Abstract： The Toona sinensis volatiles ultrasonic-assisted extraction process was optimized by single-factor and orthogonal tests based on HS-SPME，and the flavor of extractant was analyzed. The result showed that the optimum conditions of ultrasonic-assisted extraction were as follows： material-to-liquid ratio 1∶2， extraction power was 240 W， temperature 40 ℃，3 times extraction， which was based on 50 / 30 μm DVB/CAR/PDMS as extracting head， temperature 40 ℃and extraction time 30 min of HS-SPME. Flavor compounds showed that 69 species were detected in extractant by ultrasonic-assisted， which was 6 species more than HS-SPME. Aromatic / hydrocarbons （45.92%） and terpenes substances （24.26%） were the main materials in extractant by UWE-C2H5OC2H5 ， while the content of aldehydes （38.14%）， terpenoids （24.14%） and thiophene material （14.07%） was high by HS-SPME.

Key words： Toona sinensis; HS-SPME; ultrasonic

香椿為我國特種資源，其風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。隨著香椿蔬菜化栽培的推廣，科研人員在選育[2]、繁殖[3]、栽培[4]、采后保鮮[5-6]及貯藏運(yùn)輸?shù)确矫骈_展了廣泛研究，雖然香椿獨(dú)特誘人的香味是衡量其食用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值重要品質(zhì)特性，然而，受技術(shù)條件限制，香椿風(fēng)味物質(zhì)的研究卻較滯后。近年來，隨著現(xiàn)代分析手段的發(fā)展，關(guān)于香椿風(fēng)味物質(zhì)萃取的研究日益增多[7-11]，其中有機(jī)溶劑萃取法因其操作簡單、簡便易行、能較真實(shí)地反映抽提對象的香氣組成等優(yōu)點(diǎn)，成為常用方法之一[12]。陳從瑾等[13]曾用乙醚超聲波法（UWE-C2H5OC2H5）提取香椿干粉中揮發(fā)油，得到暗綠色稠狀物，此外關(guān)于有機(jī)試劑法萃取香椿，特別是新鮮香椿風(fēng)味物質(zhì)的研究甚少。然而，在實(shí)際操作過程中，利用超聲波輔助乙醚萃取新鮮香椿嫩芽揮發(fā)性成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)萃取物也呈墨綠色粘稠狀。根據(jù)前人研究，香椿中揮發(fā)性化合物復(fù)雜多樣且研究有限，有成分尚未鑒定出。若貿(mào)然直接用GC-MS檢測，對儀器和柱子是否有損傷尚不可知。

鑒于此，本試驗(yàn)利用超聲波輔助乙醚提取技術(shù)協(xié)同頂空固相微萃?。℉S-SPME-UWE-C2H5OC2H5），對新鮮香椿嫩芽揮發(fā)性成分進(jìn)行分離提取，以期為香椿揮發(fā)性成分提取提供一種新思路和方法，同時(shí)也解決香椿萃取物呈粘稠狀且成分復(fù)雜對柱子造成不可估量的影響這一難題，具有理論和實(shí)踐雙重意義，有助于推動(dòng)香椿產(chǎn)業(yè)向廣、深方向發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材 ?料

供試品種為棚栽紅油香椿，于2015年3月中旬采自河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香椿示范基地，選取新鮮、健壯、成熟度相對一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的香椿嫩芽進(jìn)行粉碎后試驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890AGC -5975CMS 型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司;HP-5MS石英毛細(xì)管色譜（30 m×0.25 μm×0.25 μm）;頂空固相微萃取裝置（包括手持式手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 萃取頭，40 mL棕色頂空瓶），美國安捷倫公司。

1.3 GC-MS分析條件

GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;載氣He，進(jìn)樣口溫度250 ℃，無分流比;柱流速1 mL·min-1;程序升溫：初溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃，保持2 min;以8 ℃·min-1的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS條件：穿梭線溫度230 ℃，電離方式為電子電離（EI），離子阱溫度230 ℃，掃描方式全掃描，掃描范圍m/z 43～800。檢索圖庫：NIST 2.0。

1.4 ?試驗(yàn)方法

1.4.1 頂空固相微萃取法條件優(yōu)化 （1）萃取流程。新鮮香椿、切碎→稱取1.0 g于40 mL棕色頂空瓶里→密封墊密封→40 ℃水浴中平衡15 min→萃取頭插入頂空瓶中，萃取30 min→立即取出，插入GC-MS解析5 min[11]。 （2）萃取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)。采用單因素逐步優(yōu)化的方法對萃取頭、萃取時(shí)間、萃取溫度進(jìn)行優(yōu)化[1]。采用萃取頭類型有50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種;采取萃取溫度有10，20，30，40，50 ℃等5個(gè)梯度;采用萃取時(shí)間有5，15，30，45，60 min 5 個(gè)梯度。根據(jù)不同梯度色譜峰的總面積確定最佳的萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取頭類型。

1.4.2 ?HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工藝優(yōu)化 基于頂空固相微萃取最佳條件，優(yōu)化超聲波輔助乙醚萃取法。

（1）工藝路線。新鮮香椿、粉碎→加乙醚，超聲萃取30 min→倒出濾液并合并→加入無水Na2SO4干燥過夜→5 000 r·min-1離心20 min→上清液揮去乙醚→萃取物→頂空瓶→頂空固相微萃取→GC-MS。

（2）工藝參數(shù)優(yōu)化。以色譜峰的總面積為響應(yīng)值，進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)。

① 超聲波輔助乙醚萃取法考察料液比、超聲波功率、提取溫度、萃取次數(shù)5個(gè)單因素，設(shè)計(jì)如下。

A：料液比設(shè)1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5等5個(gè)水平;

B：超聲波功率設(shè)60、120、180、240、300 W等5個(gè)水平;

C：提取溫度設(shè)10、20、30、40、50 ℃5個(gè)水平;

D：萃取次數(shù)設(shè)1、2、3、4、5次5個(gè)水平。

② 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、功率、溫度、萃取次數(shù)4個(gè)因素和3個(gè)水平，以總峰面積為響應(yīng)值進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的優(yōu)化 根據(jù)極性及涂層厚度的不同，選取50/30 μmDVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3種萃取頭進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。50/30 μm DVB/CAR/PDMS檢測出色譜峰數(shù)量和面積明顯比其它高，表明該類型萃取頭具有較大萃取效率。

2.1.2 ?萃取溫度的優(yōu)化 在最優(yōu)萃取頭基礎(chǔ)上進(jìn)行萃取溫度的優(yōu)化，如圖2所示，總峰面積隨萃取溫度的升高而上升，在萃取溫度為40 ℃時(shí)，總峰面積最大，為17.7×108，隨后當(dāng)萃取溫度升高到50 ℃時(shí)，總峰面積降低，推測可能是部分含硫化合物、萜烯類化合物熱不穩(wěn)定的成分分解造成的[1]。

2.1.3 ?萃取時(shí)間的優(yōu)化 在最優(yōu)萃取頭、萃取溫度的基礎(chǔ)上進(jìn)行萃取時(shí)間的優(yōu)化，如圖3所示，在5～30 min區(qū)間內(nèi)，峰面積隨著萃取時(shí)間的延長逐漸增大，隨后基本保持不變，表明萃取30 min已達(dá)到最大萃取效率，故選30 min是最佳萃取時(shí)間。

2.2 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn) 料液比、提取功率、提取溫度、萃取次數(shù)對總峰面積的影響分別如圖4所示。圖4a中，隨著料液比的增大，總峰面積逐漸升高，并在料液比1∶1.5時(shí)達(dá)到最大，隨后變化不大。顯示料液比1∶1.5比較合適。圖4b中，總峰面積隨著超聲波功率的增大而增大，在240 W時(shí)達(dá)到最大值，隨后略有下降趨勢。故選擇功率為240 W較為合適。圖4c中，總峰面積隨著萃取溫度的升高逐漸上升，40 ℃以后總峰面積變化不大，達(dá)到最大萃取效率。圖4d中，總峰面積對萃取次數(shù)的增大逐漸增大，當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)3次時(shí)，總峰面積達(dá)到最大，之后達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)達(dá)到最大萃取效率。

2.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素最佳條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。超聲波輔助乙醚法最佳條件為A3B2C2D3，即料液比1∶2，提取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)3次。由極差知， 影響香椿風(fēng)味物質(zhì)因素的主次順序?yàn)椋?A>C>B>D，即料液比>萃取溫度>功率>萃取次數(shù)。

2.3 HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3.1 香椿風(fēng)味物質(zhì)成分鑒定結(jié)果 ① 在最優(yōu)萃取條件的基礎(chǔ)上，超聲波輔助乙醚協(xié)同頂空固相微萃取香椿風(fēng)味物質(zhì)總離子的流圖如圖5a所示，圖5b為頂空固相微萃取法總離子流圖，兩種方法的對比分析結(jié)果見表4。經(jīng)鑒定，超聲波輔助乙醚聯(lián)合頂空固相微萃取法檢測出風(fēng)味物質(zhì)為69種，比單純用頂空固相微萃取法多檢測出6種，更是比陳叢瑾等[13]用乙醚超聲波提取揮發(fā)油種類多出30種。

② 兩種方法檢測出15種共有物質(zhì)，分別為2-己烯醛、2，4-二甲基噻吩、石竹烯、2，6，6三甲基-1-環(huán)己烯-1-甲醛、古巴烯、[1S-（1π4π7π]-1，2，3，4，5，6，7，8-八氫-1，4-二甲基-7-（1-異丙烯基）-薁、π石竹烯、4-亞環(huán)己基-3，3二乙基-2-戊酮、[4aR-（4aπ7π8aπ]-十氫-4a-甲基-1-亞甲基-7-（1-異丙烯基）-萘、[2R-（2π4aπ8aπ]-1，2，3，4，4a，5，6，8a-八氫-4a，8-二甲基-2-（1-甲基乙烯基）- 萘、[1S-（1π3π3aπ4π8aπ]-十氫-1，5，5，8a-四甲基-1，4-Methanoazulen-3-醇、π愈創(chuàng)木烯、5，6，7，7a四氫化-4，4，7a三甲基-2（4H）苯并呋喃酮、1-Heptatriacotanol和喇叭烯氧化物-（II）。

③ HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法萃取香椿風(fēng)味物質(zhì)中含量最高的10種物質(zhì)是1-甲基-4-（1甲基乙基）苯（7.53%）、十一烷（7.2%）、石竹烯（7.01%）、（Z）-3-十一碳烯（6.3%）、1-乙基-3-甲基-苯（6.07%）、薄荷烷（5.49%）、2-十二碳烯-丁二酸酐（3.415%）、十二烷（3.11%）、2.6.10-三甲基正十四烷（3.1%）和2，4-二甲基噻吩（3.05%）;HS-SPME法含量最高的物質(zhì)是2-己烯醛（5.16%）、2，4-二甲基噻吩（10.69%）、苯甲醛（27.2%）和π石竹烯（3.16%）。此外，HS-SPME法含有HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法所缺少的2-硫基-2-3二氫3，4-二甲基-噻吩（2.06%）。

2.3.2 香椿風(fēng)味物質(zhì)種類的構(gòu)成 香椿萃取物風(fēng)味物質(zhì)可以分為以下幾類：醛類、噻吩類、萜烯類、醇類、酮類、硫醇類等。2種方法萃取香椿風(fēng)味物質(zhì)種類組成相對含量圖如圖6所示，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法含量最高的為芳香族/烴類物質(zhì)（41.83%），其次是萜烯類物質(zhì)（22.10%）;HS-SPME法含量最高的則為醛類物質(zhì)（34.57%），其次為萜烯類物質(zhì)（21.88%），最后為噻吩類物質(zhì)（12.75%）。

3 結(jié)論與討論

（1）基于最優(yōu)頂空固相條件，萃取頭為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min，超聲波輔助乙醚法最佳條件為料液比1∶2，萃取功率240 W，提取溫度40 ℃，提取次數(shù)3次。

（2）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5和HS-SPME法萃取的風(fēng)味物質(zhì)中均含有2，4-二甲基噻吩，但HS-SPME法還含有2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩。張杰等的研究表明，2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩即為香椿特征香氣成分物質(zhì)，推測在超聲波乙醚提取的過程中，2-巰基-2，3-二氫-3，4-二甲基噻吩性質(zhì)不穩(wěn)定，是失去巰基（-H2S）造成的。另外，試驗(yàn)檢測出的2，4-二甲基噻吩與張杰等檢測出的3，4-二甲基噻吩等物質(zhì)不一樣，但可以看出它們互為同分異構(gòu)體，推測所呈現(xiàn)出來的味道相差不大，有類似于煮熟的洋蔥味和硫磺味，其具體生產(chǎn)機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

（3）HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法與陳叢瑾檢測揮發(fā)物質(zhì)分析研究結(jié)果相比，存在5種共有物質(zhì)，分別是古巴烯、石竹烯、紅沒藥烯、4，4，7a-三甲基-5，6，7，7a-四氫-2（4H）-苯并呋喃酮與愈創(chuàng)木烯。兩法主要物質(zhì)不同，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法檢測的主要物質(zhì)是芳香/烷烴和萜烯類，而超聲波輔助乙醚法為未知物、棕櫚酸、亞油酸及其氧化物等。此外，物質(zhì)香氣不僅取決于成分的種類和含量，還與其感覺閾值和相互作用密切相關(guān)[14]，HS-SPME-UWE-C2H5OC2H5法提取的風(fēng)味物質(zhì)中存在超聲波輔助乙醚法中缺少的2，4-二甲基噻吩，該物質(zhì)的氣味強(qiáng)度僅次于香椿特征香氣，閾值較高。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉常金，張杰，周爭艷，等.GC-MS分析比較3個(gè)特產(chǎn)香椿品種的揮發(fā)性成分[J].食品科學(xué)，2013，24（20）：261-267.

[2] 胡薇， 劉艷如， 繆妙青，等.多用途樹種香椿的研究綜述[J].福建林業(yè)科技，2008，35（1）：244-250.

[3] 唐強(qiáng)，李志輝，吳際友，等.毛紅椿無性系扦插繁殖試驗(yàn)研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015 ，35（1）： 67-70.

[4] 劉永紅，李曼，盧杰，等.無公害香椿的日光溫室栽培技術(shù)[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)2015，61（6） ： 123 -124.

[5] 朱永清，袁懷瑜， 高佳，等.不同商品包裝材料對紅香椿MAP 保鮮效果的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（4）：1695-1699.

[6] 王趙改，楊慧，朱廣成.減壓處理對香椿貯藏品質(zhì)的影響研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，28（6）：181-185.

[7] 李丹，周子衿，錢驍，等.不同采摘期及不同解凍方式對香椿香氣含量的影響[J].中國食物與營養(yǎng)，2012，18（2）：34-36.

[8] 李聚英，王軍，戴蘊(yùn)青，等.香椿特征香氣組分及其在貯藏中變化的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（3）：127-131.

[9] 李貴軍，汪帆.香椿嫩葉揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析[J].安徽化工，2014，40（3）：85-88.

[10] 吳艷霞.香椿莖揮發(fā)油化學(xué)成分分析[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2013（5）：147-148.

[11] MU R， WANG X， LIU S， et al.Rapid determination of volatile compounds in Toona sinensis（A.Juss.）roem by MAE-HS-SPME followed by GC-MS[J].Chromatographia，2007，65（7）：463-467.

[12] 張杰.香椿揮發(fā)性成分的分析及其呈香機(jī)理的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2013.

[13] 陳叢瑾，黃克瀛，李姣娟，等.不同方法提取香椿芽揮發(fā)油的比較研究[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2009，29（1）：30-35.

[14] 曹雪丹，方修貴，趙凱.椪柑果醋液態(tài)發(fā)酵工藝及香氣成分的GC-MS分析[J].中國食品學(xué)報(bào)，2015，15（5）：105-112.