德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因的克隆及表達模式分析

張道偉，陳 靜，袁 媛，楊 靜，錢正敏

(1.遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，貴州省赤水河流域動物資源保護與應(yīng)用研究重點實驗室，貴州遵義 563002;2.遵義醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義 563003)

德國小蠊Blattella germanica 在分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動物門Arthopoda，昆蟲綱Insecta，蜚蠊目Blattaria，是重要的城市環(huán)境衛(wèi)生害蟲之一，可攜帶多種病原菌，導(dǎo)致多種疾病的傳播和引起哮喘等過敏反應(yīng)，給人類的健康和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響(Oliva，et al.，2010;張凡，2011)。德國小蠊種群密度大，繁殖速度快，對殺蟲劑的高抗性使德國小蠊的防治成為世界性的防治難題，給疾病預(yù)防與控制工作帶來極大的困難(趙志剛等，2012)。隨著人們對食品安全和環(huán)境意識的提高以及可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略的實施，人們越來越需要一種新型環(huán)保的措施治理德國小蠊。

幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和昆蟲中腸圍食膜的必需組份，對昆蟲的發(fā)育至關(guān)重要。在進化過程中，昆蟲利用幾丁質(zhì)的剛性和化學(xué)穩(wěn)定性，形成其細(xì)胞外骨架如外表皮和中腸內(nèi)壁的圍食膜結(jié)構(gòu)，從而保護昆蟲在生長、移動和與外界交流等過程中免受環(huán)境中的各種傷害(Kramer and Muthukrishnan，2005)。由于其獨特的結(jié)構(gòu)和在昆蟲生長過程中的重要作用，加之高等動物和植物中均不含幾丁質(zhì)，因此干擾幾丁質(zhì)的合成和降解，一直是新型農(nóng)藥靶標(biāo)研究的熱點。

幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是降解幾丁質(zhì)的主要酶類之一，在自然界的存在范圍也極為廣泛。在昆蟲中的主要功能是周期性的褪去舊表皮過程中降解幾丁質(zhì)。昆蟲幾丁質(zhì)酶的研究始于19 世紀(jì)70年代，第一個幾丁質(zhì)酶基因cDNA 的克隆由Kramer 于1993年從煙草天蛾Manduca sexta 中獲得。隨后又有眾多的昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的cDNA 序列從昆蟲不同目的物種中被分離。目前已報道的幾丁質(zhì)酶主要集中在鱗翅目昆蟲(Kim et al.，1998;Bolognesi et al.，2005;Zhang et al.，2012)、雙翅目昆蟲(Feix et al.，2000，Yan et al.，2002)，而鞘翅目(Royer et al.，2002，Genta et al.，2006)及膜翅目昆蟲(Krishnan et al.，1994)等也有少量報道。在已報道的這些昆蟲中，一般只有一個基因或cDNA 序列被鑒定出來。近年來隨著越來越多昆蟲基因組序列測序工作的完成，利用生物信息學(xué)方法鑒別出多個幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因。Zhu 等2004 首先在果蠅Drosophila melanogaster 基因組發(fā)現(xiàn)存在多個幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶成員并初步將其分類。隨后Zhu 等(2008a)進一步通過搜索D.melanogaster、赤擬谷盜Tribolium castaneum和埃及伊蚊Aedes aegypti 基因組序列，結(jié)果顯示分別有23、17 和16個幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶家族基因被識別出來。Pan 等(2012)重新搜索家蠶基因組也發(fā)現(xiàn)有12個幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶被鑒定出來，說明在昆蟲中幾丁質(zhì)酶是一個多基因家族成員。識別出來的幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因通過昆蟲細(xì)胞表達重組蛋白(Zhu et al.，2008b)和注射幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA 的RNAi 實驗(Zhu et al.，2008c)進一步得到功能上的鑒定;不同類型的幾丁質(zhì)酶基因表達受到抑制后，會出現(xiàn)畸形發(fā)育、死亡等各種表型(Zhu et al.，2008c;Zhang et al.，2012)，顯示幾丁質(zhì)酶在昆蟲發(fā)育過程中的具有重要功能。這些研究表明利用幾丁質(zhì)酶在不同害蟲防治應(yīng)用有著良好的前景。本研究根據(jù)幾丁質(zhì)酶保守序列結(jié)構(gòu)設(shè)計簡并引物，從德國小蠊中克隆到其BgChi 基因的全長cDNA 序列，并進一步對其系統(tǒng)進化樹、組織和時間表達特異性進行了分析，本研究結(jié)果為利用幾丁質(zhì)酶基因為靶標(biāo)防治德國小蠊奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 德國小蠊的飼養(yǎng)

德國小蠊由貴陽醫(yī)學(xué)院張春林教授惠贈，在本實驗室內(nèi)飼養(yǎng)多代。飼養(yǎng)條件為溫度25℃±1℃，光照條件為14L∶10D，相對濕度為70%-80%，用大鼠飼料繼代飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器

SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、定量PCR 試劑(SYBR Premix Ex Taq)、pMD-18T Cloning Vector 購自寶生物(大連)有限公司，TransTaqTMHiFi DNA Polymerase 購自北京全式金生物公司，AxyPrep 質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購自愛思進生物公司，所有引物合成和序列測序由上海生物工程有限公司完成。常規(guī)PCR 儀PTC-1000、定量PCR 儀CFX96 和凝膠電泳系統(tǒng)購自Bio-rad公司、凝膠成像系統(tǒng)GelDoc-IT 購自美國Springsci 公司。

1.1.3 本研究采用的引物序列及作用

表1 德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因cDNA 擴增的策略和引物Table 1 Strategy and primers used for amplification chitinase gene cDNA in Blattella germanica

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 的提取、cDNA 合成和PCR 反應(yīng)

采用Trizol 方法提取德國小蠊從卵發(fā)育至成蟲時期的總RNA。步驟如下:將樣品放入液氮預(yù)冷的無RNase 的研缽，研磨至粉末狀，加1 mL Trizol，繼續(xù)研磨至液體;轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管，渦旋震蕩15 s，室溫靜置5 min;加入0.2 mL 氯仿，混勻靜置3-5 min，4℃，12000 g，15 min;轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管中，加入0.5 mL 異丙醇，室溫靜置10 min，4℃，12000 g 離心10 min;棄上清，加入1 mL 75% 乙醇洗滌沉淀，4℃，7500 g，5 min，棄上清;稍微干燥，用適量無RNase 的去離子保存。

首先用Nano drop-2000 微量分光光度計測定總RNA 濃度，然后再0.2 mL PCR 管中按順序加入以下樣品:1 μg 總RNA，5 μL 的5×Buffer，2 μL的dNTPs，0.5 μL 的AMV RTase，1 uL 引物dT18，補充DEPC 水至25 uL。在PCR 儀上進行如下反應(yīng):37℃，10 min;42℃，1.5 h;90℃，5 min，即獲得第一鏈cDNA。兩對簡并引物BgChi-F1，BgChi-F2，BgChi-R1 和BgChi-R2 根據(jù)已知昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計。中間片段獲得由兩輪PCR 組成，第一輪PCR 采用BgChi-F1 和BgChi-R1 為引物，進行如下反應(yīng):預(yù)變性94℃，5 min;然后30個循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min;第二輪PCR 采用BgChi-F2 和BgChi-R2 為引物，模板為第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍，進行如下反應(yīng):預(yù)變性94℃，5 min;然后30個循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，40 s。

1.2.2 目的片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗證

將第二輪PCR 產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收合適的大小片段，根據(jù)pMD-18T Cloning Vector 說明書進行連接，然后轉(zhuǎn)入DH 5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用BgChi-F2 和BgChi-R2 為引物進行菌落PCR 驗證，將陽性克隆搖菌，送樣品到上海生物工程公司進行測序。

1.2.3 BgChi 的3' RACE 和5'RACE 擴增

根 據(jù) Clontech 的 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒說明書分別構(gòu)建了德國小蠊整個發(fā)育時期(卵、1-6 齡幼蟲、雌成蟲、雄成蟲等)的5'RACE 和3'RACE cDNA 庫。特異性引物BgChi-3' GSP1 和BgChi-3' GSP2 以 及BgChi-5'GSP1 和BgChi-5'GSP2 根據(jù)獲得的中間片段設(shè)計。其中BgChi-3'GSP1 和BgChi-3'GSP2用于擴增3' RACE 片段，第一輪 PCR 采用BgChi-3'GSP1 和UPM 引物，第二輪巢氏PCR 采用BgChi-3'GSP2 和NUP 引物進行擴增，作為模板第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍;BgChi-5'GSP1 和BgChi-5'GSP2 用于擴增5'RACE 片段，第一輪PCR 采用BgChi-5'GSP1 和UPM 引物，第二輪巢氏PCR 采用BgChi-5'GSP2 和NUP 引物進行擴增，作為模板第一輪 PCR 產(chǎn)物稀釋50 倍。RACE-PCR 擴增的程序均為:預(yù)變性94℃，5 min;然后30個循環(huán)94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min。獲得的片段采用與方法1.2.2 相同的步驟進行回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗證。

1.2.4 序列分析

德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 核苷酸序列分析軟件采用DNAstar 軟件分析，其它物種幾丁質(zhì)酶從GenBank 數(shù)據(jù)庫獲得;蛋白質(zhì)功能域的搜索用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);信號肽采用 SignaIP 進行預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);結(jié)構(gòu)域分析采用 Swiss-Model(http://smart.embl-heidelberg.de/);跨膜結(jié)構(gòu)TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);核苷酸序列和氨基酸序列搜索采用在線分析工具blastn 和blastp;進化樹的構(gòu)建采用軟件Clustalw2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)和MEGA 5.1。

1.2.5 組織分布和時間表達檢測

取德國小蠊6 齡3 d(盧慧明等，2013)幼蟲的不同組織(包括表皮、脂肪體、中腸、氣管、血淋巴)，6 齡蛻皮前1-3 d 和蛻皮后1-5 d 收集樣品。按照1.2.1 中的方法提取各組織的RNA 并進行質(zhì)量檢測，然后分別取1 μL RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以rtBgChi F 和rtBgChi R 為引物進行BgChi 基因組織分布和時間表達檢測。擴增程序為:預(yù)變性94℃，5 min;然后28個循環(huán)94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，25 s。

1.2.6 熒光定量PCR 檢測

實時熒光定量PCR 采用TaKaRa 公司的Real Time PCR-SYBR Green 試劑在Bio-Rad 新一代CFX96 實時定量PCR 儀器上進行，檢測BgChi 在6 齡幼蟲期前后表達量的變化。檢測過程中以β-actin基因為內(nèi)參基因，無菌水陰性對照。每個cDNA 樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)程序為:預(yù)變性94℃，5 min;然后28個循環(huán)94℃，15 s，57℃，15 s，72℃，20 s。反應(yīng)結(jié)束后計算目的基因的Ct值和內(nèi)參基因的Ct平均值，采用2-△Ct相對定量法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因的克隆與序列分析

為了獲得德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因，首先通過GenBank 數(shù)據(jù)庫比對其它昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計簡并引物兩對BgChi-F1，BgChi-R1 和BgChi-F2，BgChi-R2 用于擴增BgChi 的中間片段。經(jīng)過兩輪PCR，獲得了一條約480 bp 左右的核苷酸片段(圖1 所示)，測序結(jié)果顯示該片段與禾沫蟬Poophilus costalis 幾丁質(zhì)酶的同源性為81%，可以初步確定擴增的中間片段為幾丁質(zhì)酶基因。根據(jù)這段序列，分別在3'端和5'端設(shè)計特異性引物。利用德國小蠊5'RACE 和3'RACE cDNA 庫，分別獲得約500 bp 和1100 bp 左右的片段(圖1 所示)。經(jīng)過回收，連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR 驗證和測序，結(jié)果表明獲得的目的基因為BgChi，屬于幾丁質(zhì)酶18 家族基因。

圖1 BgChi 基因中間片段及RACE PCR擴增的凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis analysis of BgChi part fragment and RACE amplification by PCR

通過在線分析軟件SignaIP 4.1 發(fā)現(xiàn)BgChi 蛋白N-端含有一個1-23個氨基酸的信號肽;Swiss-Model 分析表明其存在一個幾丁質(zhì)酶18 家族的催化結(jié)構(gòu)域和一個C-端的幾丁質(zhì)結(jié)合域(圖2 所示);TMHMM 2.0 軟件分析BgChi 無跨膜區(qū)域，為胞外蛋白。

在線生物軟件比對，拼接中間片段，3'和5'RACE 序列，獲得德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 的cDNA 全長為1881 bp，開放閱讀框(ORF)為1620 bp，編碼539個氨基酸(圖3 所示)。預(yù)測的分子量大小為59.7 kDa，理論等電點為5.0。BgChi蛋白含有幾丁質(zhì)酶18 家族4個保守的氨基酸序列:保守區(qū) Ⅰ:KXXXXXGGW，保守區(qū) Ⅱ:FDGXDLDWEYP，保守區(qū) Ⅲ 和 Ⅳ 分別為:MXYDXXG 和GXXXWXXDXDD，表明其屬于典型的幾丁質(zhì)酶18 家族成員，主要與昆蟲的蛻皮相關(guān)(圖3 所示);在終止密碼子TAA 的后面和polyA的前面發(fā)現(xiàn)了典型的加尾信號序列AATAAA 結(jié)構(gòu)，表明獲得的為完整的cDNA 序列。通過與其它物種中克隆得到的幾丁質(zhì)酶比對結(jié)果也證明了這點。

圖2 SMART 軟件分析BgChi 結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domain analysis of BgChi chitinase protein by SMART software

圖3 德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因序列及保守氨基酸序列分析。Fig.3 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Blattella germanica chitinase

圖4 利用MEGA 5.1 構(gòu)建的BgChi 與其它幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of BgChi and other insect chitinase genes by MEGA 5.1

2.2 BgChi 的同源性和進化分析

將BgChi 與其它昆蟲幾丁質(zhì)酶進行進化樹分析，這些物種及其基因氨基酸序列來自:德國小蠊Blattella germanica(KJ789158);禾沫蟬Poophilus costalis(AFW03959);蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis(NP_001155084);家蠶Bombyx mori(BAB13481);赤擬谷盜Tribolium castaneum(NP_001034524);岡比亞按蚊Anopheles gambiae(AAB87764);紅火蟻Solenopsis invicta(EFZ09833);野桑蠶 Bombyx mandarina(AF326596_1);埃及伊蚊Aedes aegypti(AAB81849);東方粘蟲 Mythimna separate(AAS92245);東亞飛蝗 Locusta migratoria(ABK76337);歐洲熊蜂Bombus terrestris(XP_003402985);金紋小潛細(xì)蛾P(guān)hyllonorycter ringoniella(AEP25533);二化螟 Chilo suppressalis(AAW30162);番茄夜蛾 Lacanobia oleracea(CAF05663);甜菜夜蛾 Spodoptera exigua(GU371868);亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(ABI81757);斜紋夜蛾 Spodoptera litura(BAB12678);小地老虎 Agrotis ipsilon(ABW03227);甘藍夜蛾 Mamestra brassicae(ACL30984);印度跳蟻 Harpegnathos saltator(EFN88161);小菜蛾 Plutella xylostella(ACU42267);切葉蟻 Acromyrmex echinatior(EGI64271)。圖4 結(jié)果表明德國小蠊與同翅目禾沫蟬Poophilus costalis 的親緣關(guān)系最近，與膜翅目熊峰Bombus terrestris 和切葉蟻Acromyrmex echinatior 幾丁質(zhì)酶的親緣關(guān)系次之。

2.3 BgChi 在不同組織器官的表達特性

解剖6 齡3 d 德國小蠊幼蟲組織，包括表皮、脂肪體、中腸、氣管、血細(xì)胞等，用RT-PCR 方法檢測德國小蠊幾丁質(zhì)酶BgChi 基因的表達。由圖5 結(jié)果可知:德國小蠊幾丁質(zhì)酶基因BgChi 在表皮、中腸和氣管均有表達，其中在表皮和氣管中的表達量較高，在中腸的表達量稍低。在脂肪體及血淋巴中未檢測到BgChi 基因的表達。說明幾丁質(zhì)酶的表達具有組織特異性，通常在含幾丁質(zhì)的組織中表達，如昆蟲的表皮、氣管是含有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，中腸由于內(nèi)部有圍食膜所以也含有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，在這幾個組織器官中，BgChi 的表達量較高。

圖5 RT-PCR 檢測德國小蠊幾丁質(zhì)酶BgChi 基因的組織分布Fig.5 Tissue distribution of BgChi by RT-PCR in Blattella germanica

2.4 BgChi 的時間表達結(jié)果

取6 齡幼蟲蛻皮前1-3 d 和蛻皮后1-5 d 幼蟲不同發(fā)育時期樣品，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后用定量PCR 檢測BgChi 基因mRNA 的表達情況。如圖6 所示，德國小蠊幾丁質(zhì)酶的表達量在蛻皮前達到高峰，隨著蛻皮的結(jié)束表達量隨之下降;在6 齡蛻皮幼蟲初期表達量趨于平穩(wěn)。

圖6 德國小蠊6 齡幼蟲蛻皮前后BgChi 表達量qTR-PCR 分析Fig.6 The relative mRNA expression of Bgchi during molting in 6th larval stage of Blattella germanica detected by qRT-PCR

3 結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)酶是降解幾丁質(zhì)的最主要酶類之一，廣泛存在于自然界，包括細(xì)菌，真菌，病毒，昆蟲和植物等(Arakane and Muthukrishnan，2010)。本研究通過生物信息學(xué)方法比對昆蟲幾丁質(zhì)酶保守序列，采用同源克隆及RACE-PCR 方法從德國小蠊中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因。自從1993年Kramer 等首次從煙草天蛾Manduca sexta 中克隆出全長的幾丁質(zhì)酶基因cDNA 序列，已有超過幾十種編碼幾丁質(zhì)酶基因的cDNA 序列從昆蟲不同目的多個物種中被分離出來(Kcramer et al.，1993;Bolognesi et al.，2005;Genta et al.，2006;Kim et al.，2010;Zhang et al.，2012)。特別是隨著越來越多昆蟲基因組測序工作的完成，利用生物信息學(xué)方法運用幾丁質(zhì)酶保守結(jié)構(gòu)域獲得幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶基因序列得以實現(xiàn)。Zhu 等利用生物信息學(xué)方法比對搜索果蠅、赤擬谷盜和埃及伊蚊基因組序列，結(jié)果顯示分別有16、16 和13個幾丁質(zhì)酶或類幾丁質(zhì)酶家族基因被識別出來(2008a)，表明昆蟲幾丁質(zhì)酶是多基因家族。但對于非模式昆蟲物種來講，通過構(gòu)建cDNA 文庫或利用同源克隆和RACE 擴增的方法仍是獲得靶標(biāo)功能基因的主要手段。

本研究利用同源克隆的方法從德國小蠊中只得到了一個幾丁質(zhì)酶基因，但通過序列比對和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn):BgChi 含有幾丁質(zhì)酶典型的結(jié)構(gòu)域(如圖2 和圖3 所示):1個N-端的信號肽序列，1個幾丁質(zhì)催化區(qū)域，1個C-端的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域，以及連接催化區(qū)和結(jié)合區(qū)之間的連接區(qū)域。這和昆蟲幾丁質(zhì)酶家族Group 1 的分類特征完全一樣(Zhu et al.，2008a)。Group 1 幾丁質(zhì)酶家族主要在表皮、中腸和氣管分布，在昆蟲蛻皮階段(幼蟲-幼蟲、幼蟲-蛹、蛹-成蟲)前表達降解老的舊表皮(Daimon et al.，2005)，在這些變態(tài)階段蛻皮激素對其具有正調(diào)控作用，保幼激素起負(fù)調(diào)控作用(Zhu et al.，2008a)。氨基酸序列研究表明，BgChi 具有昆蟲幾丁質(zhì)酶4個保守的氨基酸序列:KXXXXXGGW，F(xiàn)DGXDLDWEYP，MXYDXXG 和GXXXWXXDXDD，是幾丁質(zhì)酶催化結(jié)構(gòu)域的重要功能區(qū)域，與幾丁質(zhì)酶的活性密切相關(guān)(Zhang et al.，2002;Zhu et al.，2004;Zhu et al.，2008b)。BgChi 幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)約含60個氨基酸，主要功能使幾丁質(zhì)酶結(jié)合不溶性的幾丁質(zhì)底物提高降解效率。用分子生物學(xué)軟件對幾丁質(zhì)酶的糖基化位點進行分析顯示，多數(shù)糖基化位點位于連接區(qū)域和部分催化區(qū)。除了糖基化作用之外還存在多個硫酸化和磷酸化作用位點，它們的修飾對蛋白功能的發(fā)揮也起到重要作用。

隨著多個昆蟲基因組測序工作的完成和生物信息學(xué)手段的使用使我們明確昆蟲幾丁質(zhì)酶是多基因家族，而RNAi 技術(shù)的發(fā)展成熟則使我們能鑒定家族中的不同成員在昆蟲發(fā)育中的具體功能。這些被識別出來的幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶成員進一步通過昆蟲細(xì)胞表達重組蛋白和通過注射幾丁質(zhì)酶家族成員的特異性dsRNA 的RNAi 實驗得到功能上的鑒定，確認(rèn)其與幾丁質(zhì)降解有密切關(guān)系。在赤擬谷盜中，RNAi 沉默Group 1 幾丁質(zhì)酶TcChi5 導(dǎo)致注射組在成蟲階段完全死亡，RT-PCR 檢測結(jié)果表明正是TcChi5 轉(zhuǎn)錄本的降低所導(dǎo)致(Zhu et al.，2008c)。通過注射能夠產(chǎn)生表型的還有隸屬于其它組的幾丁質(zhì)酶成員如TcChi10，TcChi7 和IDGF4。注射TcChi10 dsRNA 不僅導(dǎo)致幼蟲-幼蟲期間不能完成蛻皮而死亡，而且幼蟲-蛹、蛹-成蟲階段也不能順利完成發(fā)育，死亡率幾乎達到100%。幾丁質(zhì)酶基因TcChi7 對赤擬谷盜腹部的形成和翅膀的發(fā)育時不可缺少的，沉默其表達導(dǎo)致出現(xiàn)腹部發(fā)育不全和翅膀畸形(Zhu et al.，2008c)。相似的研究成果在甜菜夜蛾中也得到驗證，抑制SeChi 基因的表達會影響其幼蟲階段的蛻皮;而抑制SeChi-h 基因的表達則會影響幼蟲化蛹及成蟲的羽化(Zhang et al.，2012)。說明Group 1 幾丁質(zhì)酶基因在昆蟲的生長發(fā)育中具有重要功能，通過抑制其表達則在害蟲防治中有著良好的應(yīng)用前景。

由于昆蟲的圍食膜和表皮主要是由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，利用幾丁質(zhì)酶來降解昆蟲含幾丁質(zhì)的組織來抑制害蟲的正常生理活動，從而可以達到防治害蟲的目的(李瑤和范曉軍，2011)。同時，高等植物和高等動物并不含幾丁質(zhì)，因此利用幾丁質(zhì)酶防治害蟲是一種相對安全、有效的手段，而針對幾丁質(zhì)代謝水平設(shè)計開發(fā)新型農(nóng)藥品種，其應(yīng)用前景也必將極為廣闊。

References)

Arakane Y，Muthukrishnan S.Insect chitinase and chitinase-like proteins［J］.Cell Mol.Life Sci.，2010，67(2):201-216.

Bolognesi R，Arakane Y，Muthukrishnan S，et al，.Sequences of cDNAs and expression of genes encoding chitin synthase and chitinase in the midgut of Spodoptera frugiperda［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2005，35(11):1249-1259.

Daimon T，Katsuma S，Iwanaga M，et al.The BmChi-h gene，a bacterial-type chitinase gene of Bombyx mori，encodes a functional exochitinase that plays a role in the chitin degradation during the molting process［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2005，35(10):1112-1123.

Genta FA，Blanes L，Cristofoletti PT，et al.Purification，characterization and molecular cloning of the major chitinase from Tenebrio molitor larval midgut［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2006，36(10):789-800.

Kim JS，Je YH.A novel biopesticide production:attagel-mediated precipitation of chitinase from Beauveria bassiana SFB-205 supernatant for thermotolerance［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2010，87(5):1639-1648.

Kramer KJ，Corpuz L，Choi HK，et al.Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，1993，23(6):691-701.

Kramer KJ，Muthukrishnan S.Chitin Metabolism in Insects［M］.Oxford:Elsevier Press，2005，111-134.

Li Y，F(xiàn)an J.Insect chitinase and its application in insect pest control［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，2011，48(5):1489-1494.［李瑤，范曉軍.昆蟲幾丁質(zhì)酶及其在害蟲防治中的應(yīng)用［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2011，48(5):1489-1494］

Lu HM，Meng FX，Gao CF，et al.Study on physical characteristics of Blattella germanica in different nymphal instars［J］.Chin.J.Vector Biol.＆ Control，2013，24(2):125-127.［盧慧明，孟鳳霞，高聰芬，等.德國小蠊若蟲齡期區(qū)別的體征研究［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2013，24(2):125-127］

Merzendorfer H，Zimoch L.Chitin metabolism in insects:structure，function and regulation of chitin synthases and chitinases［J］.J.Exp.Biol.，2003，206:4393-4412.

Oliva GR，Díaz C，F(xiàn)uentes GO，et al.Blatella germanica as a possible cockroach vector of micro-organisms in a hospital［J］.Journal of Hospital Infection，2010，1:93-95.

Pan Y，Lu P，Wang Y，et al.In silico identification of novel chitinaselike proteins in the silkworm，Bombyx mori，genome［J］.J.Insect Sci.，2012，12:150.

Zhang DW，Chen J，Yao Q，et al.Functional analysis of two chitinase genes during the pupation and eclosion stages of the beet armyworm Spodoptera exigua by RNA interference［J］.Arch.Insect Biochem.Physiol.，2012，79(3-4):220-234.

Zhang F.Advances in mechanisms of insecticide resistance in Blattella germanica［J］.Chemistry of Life，2011，31(5):747-750.［張凡.德國小蠊抗藥性機理［J］.生命的化學(xué)，2011，31(5):747-750］

Zhang H，Huang X，F(xiàn)ukamizo T，et al.Site-directed mutagenesis and functional analysis of an active site tryptophan of insect chitinase［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2002，32(11):1477-1488.

Zhao ZG，Huo XB，Wang XJ，et al.Resistance of Blattella germanicato nine kinds of commonly used insecticides［J］.Chin.J.Hyg.Insect ＆ Rquip.，2012，18(1):38-40.［趙志剛，霍新北，王學(xué)軍，等.德國小蠊對9種常用殺蟲劑的抗性測定［J］.中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2012，18(1):38-40］

Zhu Q，Arakane Y，Banerjee D，et al.Domain organization and phylogenetic analysis of the chitinase-like family of proteins in three species of insects［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2008a，38(4):452-466.

Zhu Q，Arakane Y，Beeman RW，et al.Characterization of recombinant chitinase-like proteins of Drosophila melanogaster and Tribolium castaneum［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2008b，38(4):467-477.

Zhu Q，Arakane Y，Beeman RW，et al.Functional specialization among insect chitinase family genes revealed by RNA interference［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2008c，105(8):6650-6655.

Zhu Q，Deng Y，Vanka P，et al.Computational identification of novel chitinase-like proteins in the Drosophila melanogaster genome［J］.Bioinformatics，2004，20(2):161-169.