水抽提物對(duì)稀酸預(yù)處理玉米秸稈酶水解的影響

榮亞運(yùn)，仲如霞，朱均均,2*，姚 瑤，徐 勇,2，勇 強(qiáng)，余世袁,2

水抽提物對(duì)稀酸預(yù)處理玉米秸稈酶水解的影響

榮亞運(yùn)1，仲如霞1，朱均均1,2*，姚 瑤1，徐 勇1,2，勇 強(qiáng)1，余世袁1,2

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

采用水抽提方法得到玉米秸稈中的水抽提液，研究水抽提液、水抽提液的稀酸水解液對(duì)水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈酶水解性能的影響。研究結(jié)果表明，與未處理玉米秸稈相比，水抽提玉米秸稈的酶水解性能有所提高，從48 h的9.88%提高到23.56%；與稀酸預(yù)處理玉米秸稈相比，稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈酶水解性能略有提高，從48 h的67.07%提高到73.44%；通過(guò)向水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈中添加水抽提液的酶水解結(jié)果表明，與未添加的空白樣相比，添加水抽提液對(duì)酶水解得率的影響極?。?%以內(nèi)），但水抽提液經(jīng)過(guò)稀酸水解后再添加到水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈中，可以發(fā)現(xiàn)與未添加的空白樣相比，酶水解得率大幅度降低，酶解48 h時(shí)分別下降了15.03%和13.96%，這說(shuō)明水抽提液在稀酸預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生了對(duì)酶水解有抑制作用的物質(zhì)。因此，通過(guò)水抽提去除部分水抽提物可減少稀酸預(yù)處理過(guò)程中抑制物的產(chǎn)生，從而提高酶水解得率的能力。

水抽提物；玉米秸稈；稀酸預(yù)處理；抑制物；酶水解

隨著全球能源和糧食短缺危機(jī)以及環(huán)境污染日益嚴(yán)重，利用豐富的、可再生的木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化制取生物質(zhì)液體燃料（燃料乙醇、生物丁醇、生物柴油、碳?xì)淙剂系龋┦钱?dāng)今世界各國(guó)研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。通過(guò)轉(zhuǎn)酯化和發(fā)酵生產(chǎn)的生物柴油和燃料乙醇主導(dǎo)目前的生物燃料市場(chǎng)[1-2]。而以木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)碳?xì)淙剂鲜俏磥?lái)的發(fā)展方向，可以通過(guò)微生物發(fā)酵直接獲得[3-4]或者利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂后再通過(guò)加氫脫氧―裂化異構(gòu)兩段加氫獲得[5-6]。然而，不管以木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇或者生產(chǎn)油脂進(jìn)而轉(zhuǎn)化為生物柴油或者碳?xì)淙剂希婕暗侥举|(zhì)纖維原料的預(yù)處理、酶水解和糖液發(fā)酵等關(guān)鍵技術(shù)[7]，尤其在第一步預(yù)處理過(guò)程中，不可避免地產(chǎn)生抑制物，主要包括兩大類：一是碳水化合物降解產(chǎn)物，如甲酸、乙酸、乙酰丙酸、5-羥甲基糠醛、糠醛；二是木質(zhì)素降解產(chǎn)物，如4-羥基苯甲醛、香草醛、紫丁香醛、4-羥基苯甲酸、香草酸、紫丁香酸、3,4-二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸等。這些抑制物嚴(yán)重影響了微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。因此，對(duì)這些抑制物的脫毒以及篩選能夠耐受這些抑制物的微生物是降低木質(zhì)纖維制取生物質(zhì)液體燃料成本的基本手段[8-10]。由于玉米秸稈中含有葉子，因此其提取物含量高，本研究通過(guò)水抽提的方法提取水抽提物，借助經(jīng)典的稀硫酸預(yù)處理技術(shù)對(duì)水抽提物進(jìn)行稀酸水解以及玉米秸稈和水抽提玉米秸稈進(jìn)行稀酸預(yù)處理，研究水抽提液、水抽提液的稀酸水解液對(duì)水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈酶水解性能的影響。因此通過(guò)本文的研究，可以揭示水抽提物對(duì)酶水解的影響，為減少抑制物的產(chǎn)生、提高酶水解得率提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 玉米秸稈

玉米秸稈來(lái)源于內(nèi)蒙古呼和浩特市，經(jīng)粉碎至0.2～0.4 mm后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 玉米秸稈水抽提液的制備

稱取相當(dāng)于50 g絕干的玉米秸稈于1 L三角瓶中，加入固液比（g/mL，下同）1∶10的蒸餾水，攪拌均勻浸泡一定時(shí)間后，在121℃的高壓滅菌鍋中反應(yīng)60 min，取出，于冷水中冷卻至室溫，抽濾后得到的濾液即為水抽提液，收集備用；而抽濾后得到的固體渣用水洗至中性后，稱為水抽提玉米秸稈，收集備用[11]。

1.3 玉米秸稈/水抽提玉米秸稈稀酸預(yù)處理

稱取相當(dāng)于3.5 g絕干玉米秸稈/水抽提玉米秸稈于自制的不銹鋼反應(yīng)器（容積為35 mL）中，按固液比為1∶10、最終濃度為0.75%的稀硫酸溶液浸泡12 h后，置于150℃的油浴鍋中保溫30 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即取出反應(yīng)器，置于冷水中驟冷，采用G1玻砂抽濾后的固體渣，按固液比為1∶5（以起始原料為基準(zhǔn)）、60℃左右的水充分洗滌、抽濾3次后合并濾液，即為玉米秸稈/水抽提玉米秸稈的稀酸預(yù)水解液，備用[12]；洗滌后得到的固體渣，收集備用。

1.4 玉米秸稈水抽提液稀硫酸水解

稱取一定質(zhì)量的水抽提液于自制的35 mL不銹鋼反應(yīng)器中，加入一定質(zhì)量的濃硫酸，使其最終濃度為0.75%，混勻后置于150℃的油浴鍋中保溫30 min，反應(yīng)結(jié)束后，立即取出反應(yīng)器，置于冷水中驟冷，采用G1玻砂抽濾后得到的濾液，即為玉米秸稈水抽提液的稀酸水解液，收集備用[13]。

1.5 酶制劑

纖維素酶（C2730）：來(lái)自Trichoderma reesei ATCC 26921，丹麥諾維信（Novozyme）生產(chǎn)，Sigma公司提供。β-葡萄糖苷酶（C6105）：來(lái)自Aspergillus niger，丹麥諾維信（Novozyme）生產(chǎn)，Sigma公司提供。

1.6 纖維素酶水解

在50 mL的三角瓶中，加入相當(dāng)于2.0 g絕干的物料，再加入2 mL的l moL/L的檸檬酸緩沖溶液（稀釋20倍后pH值為4.8），按30 FPU/g（以纖維素計(jì)，下同）的用量加入纖維素酶，10 IU/g的用量加入β-葡萄糖苷酶，40 mL酶解體系，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓庾∑靠?，?0℃、150 r/min搖床中酶解48、72 h。酶解結(jié)束后樣品于10 000 r/min下離心5 min，取上清液測(cè)定纖維二糖和葡萄糖的濃度。

纖維素酶水解得率的計(jì)算公式如式（1）所示。

1.7 分析方法

1.7.1 原料分析

原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的分析按美國(guó)能源部可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）的方法測(cè)定[13]。

1.7.2 水分測(cè)定

原料中水分含量的測(cè)定采用紅外水分測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定。

1.7.3 糖、抑制物含量的測(cè)定

糖（纖維二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）、抑制物（甲酸、乙酸、乙酰丙酸、5-羥甲基糠醛和糠醛）含量的測(cè)定采用高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 1260型）進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量[14]。分析條件如下：色譜柱為Bio-Rad HPX-87H柱（7.8 mm × 300 mm），柱溫為55℃，流動(dòng)相為5 mmol/L的硫酸，流速為0.6 mL/min，上樣量為10 μL，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料成分分析

玉米秸稈、水抽提后得到的玉米秸稈以及分別經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理（固液比1∶10，硫酸濃度0.75%，溫度150℃，時(shí)間30 min）后得到的固體渣，采用NREL法對(duì)其組成成分進(jìn)行分析，其結(jié)果如表1所示。

表1 玉米秸稈處理前后主要成分

從表1可以看出，與未處理的玉米秸稈相比，玉米秸稈經(jīng)固液比1∶10、121℃、60 min水抽提后，纖維素的含量略有上升，這說(shuō)明在水抽提過(guò)程中，有部分可溶性物質(zhì)（無(wú)機(jī)鹽、木質(zhì)素和少量可溶性糖類）溶出，而對(duì)半纖維和木質(zhì)素含量的變化影響不大。玉米秸稈和水抽提玉米秸稈分別經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后，半纖維素含量下降幅度很大，分別下降到6.90%和5.92%，這說(shuō)明在稀酸預(yù)處理過(guò)程中，絕大部分半纖維素被降解為可溶性糖類溶解出來(lái)，從而提高纖維素酶對(duì)纖維素的可及度[15]；纖維素的相對(duì)含量均大幅度提高，分別提高到53.01%和58.59%，這是由于半纖維素脫除的效果；而木質(zhì)素的含量相對(duì)有所增加。此外通過(guò)比較稀酸預(yù)處理玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈成分可以看出，經(jīng)過(guò)水抽提后的玉米秸稈，其纖維素含量相對(duì)較高，半纖維素和木質(zhì)素含量相對(duì)低一些，這都說(shuō)明玉米秸稈經(jīng)過(guò)水抽提去除部分可溶物質(zhì)后有利于稀酸預(yù)處理，從而提高其纖維素的含量。

2.2 水抽提液、玉米秸稈和水抽提玉米秸稈稀酸預(yù)處理后濾液成分分析

水抽提液、玉米秸稈和水抽提玉米秸稈經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理（固液比1∶10，硫酸濃度0.75%，溫度150℃，時(shí)間30 min）前后得到的濾液，采用HPLC測(cè)定其中的糖及抑制物濃度，結(jié)果如表2所示。

表2 水抽提液、玉米秸稈和水抽提玉米秸稈稀酸預(yù)處理后濾液成分分析

續(xù)表2

從表2中可以看出， 玉米秸稈經(jīng)過(guò)水抽提后得到的水抽提液中含有四種糖類，木糖含量最高，為0.92 g/L，阿拉伯糖濃度最低，僅為0.06 g/L；主要含有的抑制物為甲酸、乙酸和5-羥甲基糠醛，這說(shuō)明在熱水抽提過(guò)程中也促使了抑制物的產(chǎn)生。通過(guò)對(duì)水抽提液進(jìn)行稀酸水解后，可以發(fā)現(xiàn)糖類中的纖維二糖濃度降為0，這說(shuō)明稀酸促進(jìn)纖維二糖水解為葡萄糖。通過(guò)計(jì)算，理論上0.33 g/L的纖維二糖僅能產(chǎn)生0.37 g/L葡萄糖，而水抽提液的稀酸水解液與水抽提液中葡萄糖濃度差為0.46 g/L，可能還有部分葡萄糖會(huì)降解為5-羥甲基糠醛、甲酸和乙酰丙酸[16]，因此在玉米秸稈水抽提液可能還有部分可溶性纖維低聚糖。此外，在水抽提液稀酸水解液中，五種抑制物的濃度均有不同程度的增加，這說(shuō)明在稀酸預(yù)處理過(guò)程中，促使了葡萄糖、木糖的降解以及進(jìn)一步降解[17]。通過(guò)對(duì)玉米秸稈和水抽提玉米秸稈稀酸預(yù)處理后的預(yù)水解液中的糖成分進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，木糖含量最高，這是因?yàn)橄∷崮軌蛩獍肜w維素；而抑制物濃度中，乙酸濃度相當(dāng)，玉米秸稈稀酸預(yù)水解液中5-羥甲基糠醛濃度大于水抽提玉米秸稈的稀酸預(yù)水解液中的5-羥甲基糠醛，糠醛濃度關(guān)系則相反。

2.3 玉米秸稈稀酸預(yù)處理前后酶水解性能

在50 mL三角瓶中，分別加入一定質(zhì)量的玉米秸稈、稀酸預(yù)處理玉米秸稈，在底物濃度為5%（w/V）、pH4.8、溫度50℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、纖維素酶用量30 FPU/g、β-葡萄糖苷酶用量10 IU/g的條件下酶水解48、72 h，分別取樣，滅活、離心后的上清液采用HPLC分析其中糖的濃度，并計(jì)算其酶水解得率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，未經(jīng)處理的玉米秸稈的酶水解得率很低，酶解48 h時(shí)僅為9.88%，延長(zhǎng)時(shí)間至72 h時(shí)酶水解得率也僅提高到13.94%，這說(shuō)明由于木質(zhì)纖維原料結(jié)構(gòu)比較緊密，不經(jīng)過(guò)預(yù)處理打開(kāi)木質(zhì)纖維原料的三維空間結(jié)構(gòu)不利于纖維素酶的水解作用[18]。通過(guò)研究稀酸預(yù)處理玉米秸稈的酶水解性能發(fā)現(xiàn)，在酶解48 h時(shí)酶水解得率就達(dá)到67.07%，酶解72 h時(shí)酶水解得率略有提高，達(dá)到68.10%，這說(shuō)明木質(zhì)纖維原料經(jīng)過(guò)適當(dāng)預(yù)處理后，可以達(dá)到提高纖維素酶水解得率的目的[15]。

圖1 玉米秸稈及稀酸預(yù)處理玉米秸稈酶水解性能

圖2 水抽提玉米秸稈及稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈酶水解性能

2.4 水抽提玉米秸稈稀酸預(yù)處理前后酶水解性能

在50 mL三角瓶中，分別加入一定質(zhì)量的水抽提玉米秸稈、稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈，在與“2.3”相同條件下酶水解48、72 h，分別取樣，滅活、離心后的上清液采用HPLC分析其中糖的濃度，并計(jì)算其酶水解得率，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，玉米秸稈經(jīng)過(guò)水抽提后，酶解48 h的酶水解得率達(dá)到23.56%，延長(zhǎng)酶解時(shí)間至72 h對(duì)酶水解得率的提高影響不大。與未經(jīng)處理的玉米秸稈酶水解得率相比，酶解48 h的酶水解得率提高了138.46%，這說(shuō)明通過(guò)水抽提也能提高酶水解得率。對(duì)比稀酸預(yù)處理玉米秸稈也可以發(fā)現(xiàn)，稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈的酶水解得率也有所提高（48 h時(shí)73.44%）。因此，水抽提后的玉米秸稈進(jìn)一步采用稀酸預(yù)處理，有利于提高纖維素酶水解得率。

2.5 水抽提液及其稀酸水解液對(duì)水抽提玉米秸稈酶水解性能的影響

在50 mL三角瓶中，分別加入一定質(zhì)量的水抽提玉米秸稈、一定體積的水抽提液或水抽提液稀酸水解液，在與“2.3”相同條件下酶水解48、72 h，分別取樣，滅活、離心后的上清液采用HPLC分析其中糖的濃度，并計(jì)算其酶水解得率，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，向水抽提玉米秸稈中加入水抽提液后，其酶水解得率與未添加的相比較略有降低，但下降幅度不大，這說(shuō)明水抽提液中不含或者含有很少對(duì)酶水解有抑制作用的物質(zhì)。當(dāng)水抽提玉米秸稈中加入水抽提液稀酸水解液后，可以發(fā)現(xiàn)酶水解得率大幅度降低，分別下降到48 h的8.53%和72 h的9.07%，分別下降了15.03%和15.14%。這說(shuō)明水抽提液中的物質(zhì)經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后產(chǎn)生了對(duì)酶水解有抑制作用的物質(zhì)，從表2中抑制物濃度的增加也可以看出。因此，通過(guò)水抽提去除部分物質(zhì)將會(huì)減少后續(xù)抑制物的產(chǎn)生對(duì)酶水解的影響。

圖3 水抽提玉米秸稈中添加水抽提液及其稀酸水解液后酶水解性能

圖4 稀酸預(yù)處理水抽提玉米秸稈中添加水抽提液及其稀酸水解液后酶水解性能

2.6 水抽提液及其稀酸水解液對(duì)稀酸預(yù)處理水抽提玉米秸稈酶水解性能的影響

在50 mL三角瓶中，分別加入一定質(zhì)量的稀酸預(yù)處理水抽提玉米秸稈、一定體積的水抽提液或水抽提液稀酸水解液，在與“2.3”相同條件下酶水解48、72 h，分別取樣，滅活、離心后的上清液采用HPLC分析其中糖的濃度，并計(jì)算其酶水解得率，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，向稀酸預(yù)處理水抽提玉米秸稈添加水抽提液后，其酶水解得率與未添加的相比較略有降低或變化不大，而當(dāng)水抽提玉米秸稈中加入水抽提液稀酸水解液后，可以發(fā)現(xiàn)酶水解得率大幅度降低，分別下降到48 h的59.48%和72 h的62.83%，分別下降了13.96%和11.21%。這說(shuō)明水抽提液中的物質(zhì)經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后產(chǎn)生了對(duì)酶水解有抑制作用的物質(zhì)，因此，通過(guò)水抽提去除部分水抽提物可減少稀酸預(yù)處理過(guò)程中抑制物的產(chǎn)生，從而提高酶水解得率的能力。

3 結(jié)論

本文主要研究了玉米秸稈水抽提液對(duì)稀酸預(yù)處理玉米秸稈酶水解的影響，研究結(jié)果表明，玉米秸稈經(jīng)過(guò)水抽提后，可部分抽提出可溶性低聚糖和抑制物。添加水抽提液對(duì)水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理的水抽提玉米秸稈的酶水解性能影響不大，但添加水抽提液的稀酸水解液對(duì)水抽提玉米秸稈和稀酸預(yù)處理水抽提玉米秸稈的酶水解性能產(chǎn)生較大影響，酶水解得率下降了11%～15%之間，這說(shuō)明在稀酸預(yù)處理過(guò)程中，抽提出的水抽提物可產(chǎn)生對(duì)酶水解有抑制作用的物質(zhì)，降低了纖維素酶水解得率。

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Effect of Water Extractives on Enzymatic Hydrolysis of Dilute Sulfuric Acid Pretreated Corn Stover

RONG Ya-yun1, ZHONG Ru-xia1, ZHU Jun-jun1,2,*, YAO Yao1, XU Yong1,2, YONG Qiang1, YU Shi-yuan1,2
（1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuel and Chemicals, Nanjing 210037, China）

Water extracted materials were obtained by water extraction of corn stover. The effects of water extractives and hydrolyzate of water extractives hydrolyzed by dilute acid on enzymatic hydrolysis of water extracted corn stover (WECS) and dilute acid pretreated WECS (DAP-WECS) were investigated. The results showed that the enzymatic hydrolysis yield of WECS was improved from 9.88% to 23.56% at hydrolysis of 48 h, compared with the un-pretreated corn stover. The enzymatic hydrolysis yield of DAP-WECS enhanced a little, from 67.07% to 73.44% at hydrolysis of 48 h, compared with dilute acid pretreated corn stover. When water extractives were added to the WECS and the DAP-WECS, the added water extractive had a little effect on enzymatic hydrolysis yield (below 2%) compared with the control. However, when the hydrolyzate of water extractives hydrolyzed by dilute acid was added to the WECS and the DAP-WECS, it could be found that the enzymatic hydrolysis yield decreased dramatically compared with the control. The enzymatic hydrolysis yields at 48 h were decreased by 15.03% and 13.96%, respectively. This indicated that some inhibition materials were generated during the process of water extractives pretreated by dilute acid. Therefore a part of water extractives removed through water extraction could reduce the inhibitors generation during the dilute acid pretreatment, so as to improve the ability of enzymatic hydrolysis yield.

water extractives; corn stover; dilute sulfuric acid pretreatment; inhibitor; enzymatic hydrolysis

TQ353；Q815

A

1004-8405(2015)03-0008-07

10.16561/j.cnki.xws.2015.03.09

2015-6-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31100432）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目資助（2015BAD15B09）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（SJLX15_0405）。

榮亞運(yùn)（1990～），男，碩士研究生；研究方向：生物工程。1239589924@qq.com

* 通訊作者：朱均均（1979～），男，博士，副教授；研究方向：生物化工。zhujj@njfu.edu.cn