耐溫耐堿木聚糖―果膠復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)桑枝全稈形態(tài)、成分和制漿特性的影響

楊 艷，王 平，姚慶玲，郭麗芳，翟華敏*

耐溫耐堿木聚糖―果膠復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)桑枝全稈形態(tài)、成分和制漿特性的影響

楊 艷，王 平，姚慶玲，郭麗芳，翟華敏*

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

為了有效利用豐富的桑枝纖維資源，研究了自產(chǎn)木聚糖―果膠復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)桑枝全稈形態(tài)、成分和蒸煮特性的影響。結(jié)果表明：1）自產(chǎn)的酶是由木聚糖酶、果膠酶和少量纖維素酶組成的復(fù)合酶，該酶具有耐溫耐堿性能；2）預(yù)處理能一定程度降解桑枝的化學(xué)成分、增加纖維組織的多孔性，可為桑枝轉(zhuǎn)化利用創(chuàng)造有利條件；3）預(yù)處理明顯改善了Soda-AQ脫木質(zhì)素的選擇性，提高紙漿得率，節(jié)省蒸煮用堿量。該復(fù)合酶處理方法有潛在的應(yīng)用前景。

木聚糖―果膠復(fù)合酶；桑枝全稈；組織形態(tài)；化學(xué)成分；蒸煮特性

我國(guó)木材資源嚴(yán)重不足，開(kāi)發(fā)各類纖維資源用于制漿極為重要[1]。我國(guó)蠶桑資源相當(dāng)豐富，江浙地區(qū)每年約產(chǎn)400多萬(wàn)噸的桑枝條廢棄物[2]。桑枝全稈的綜纖維素高（約76%），纖維形態(tài)較好（平均長(zhǎng)約2.7 mm），是良好的造紙纖維原料[3]，若能將桑枝全稈高效利用，將一定程度緩解我國(guó)造紙?jiān)隙倘钡膯?wèn)題。

造紙工業(yè)上，木聚糖酶在制漿原料預(yù)處理、紙漿漂白、廢紙脫墨和纖維改性等方面已有應(yīng)用[4-7]。然而，多數(shù)木聚糖酶使用條件為pH5.0和溫度50℃左右，因缺乏耐溫耐堿性而不能與現(xiàn)行的生產(chǎn)流程和工藝銜接，限制了其造紙工業(yè)應(yīng)用，因此，有必要研究開(kāi)發(fā)耐溫耐堿木聚糖酶[8]。桑枝中含有果膠，在制漿中果膠不但消耗一定量的堿，還會(huì)造成桑皮脫膠不全引起紙漿塵埃度高的問(wèn)題，果膠酶能有效化解這一難題[9]。研究表明，合理的復(fù)合酶系可發(fā)生協(xié)同降解作用，明顯優(yōu)于單一酶的作用效果[10]。

化學(xué)制漿過(guò)程是多相反應(yīng)過(guò)程，蒸煮化學(xué)品能均勻滲透到桑枝片組織內(nèi)并反應(yīng)，是實(shí)現(xiàn)均勻蒸煮、選擇性脫木質(zhì)素的關(guān)鍵，其本質(zhì)與切片組織的松散性、多孔性有關(guān)。在前期研究復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)桑芯成分和組織形態(tài)影響的基礎(chǔ)上[11]，本文研究耐溫耐堿木聚糖―果膠復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)桑枝全稈組織形態(tài)、化學(xué)成分和Soda-AQ蒸煮特性的影響，試圖從機(jī)理和蒸煮特性方面說(shuō)明復(fù)合酶處理對(duì)桑枝組織多孔性及其反應(yīng)性的影響規(guī)律，為桑枝制漿及生物煉制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料

桑枝（Morus alba L.），全稈，取自南通，除去桑葉、粉塵等雜質(zhì)后，切成規(guī)格為長(zhǎng)約10 mm、寬約5 mm、厚約2 mm的桑片。風(fēng)干，置于密封袋中恒重、備用。

木聚糖―果膠復(fù)合酶（以下簡(jiǎn)稱復(fù)合酶），自制，由堿芽孢稈菌誘導(dǎo)篩選的菌株產(chǎn)生。酶活測(cè)定按文獻(xiàn)[12-14]方法在pH8.0條件下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶預(yù)處理

復(fù)合酶預(yù)處理桑枝全稈切片在聚乙烯密封袋中進(jìn)行，預(yù)熱后的切片和經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶解液在密封塑料袋中混合均勻，在設(shè)定的酶用量、pH（用氫氧化鈉―硼酸―氯化鉀緩沖液調(diào)節(jié)）、時(shí)間和底物濃度（10.0%）下恒溫水浴加熱，反應(yīng)過(guò)程中每隔15 min搓揉一次，以保證切片與酶解液均勻混合。處理后洗凈試樣，一部分平衡水分測(cè)定底物得率，另一部分風(fēng)干粉碎，取40～60目級(jí)分，平衡水分，用于分析。

1.2.2 蒸煮

酶處理前后的桑枝切片，用Soda-AQ法蒸煮。蒸煮工藝：用堿量18%（Na2O計(jì)），AQ用量0.05%，液比1∶6；裝罐溫度30℃，空轉(zhuǎn)30 min，以2℃/min升至最高溫度168℃，保溫2 h。蒸煮終點(diǎn)收集黑液用于殘堿分析；漿料洗至酚酞無(wú)顯色，脫水，恒定水分，用于分析。

1.2.3 化學(xué)成分分析

化學(xué)成分按TAPPI標(biāo)準(zhǔn)方法分析：水分（T264 cm-97）、綜纖維素（T249 om-00）、酸溶木質(zhì)素（T13 wd-74）、酸不溶木質(zhì)素（T222 om-88），黑液殘堿（T625 cm-85）。

綜纖維素、木質(zhì)素脫除率按公式（1）、（2）計(jì)算。

1.2.4 掃描電鏡（SEM）分析

組織表面分析：試樣經(jīng)臨界點(diǎn)干燥儀（Quorum/Emitech K850, 英國(guó)）干燥，離子濺射儀（日立E-1010，日本）噴金，用環(huán)境掃描電鏡（FEI Quanta 200，荷蘭）觀察。

組織橫斷面分析：采用環(huán)氧樹(shù)脂包埋法，70℃聚合12 h，用離子濺射儀（日立E-1010，日本）噴金，用環(huán)境掃描電鏡（FEI Quanta 200，荷蘭）觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有化學(xué)分析均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取數(shù)據(jù)平均值，并按照數(shù)據(jù)處理規(guī)則處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合酶系的組成及耐溫特性

復(fù)合酶的組成及溫度對(duì)酶活的影響如表1所示。由表1可見(jiàn)，此復(fù)合酶以木聚糖酶為主，同時(shí)含有較高酶活的果膠酶和少量的纖維素酶，不含漆酶。果膠酶酶活高對(duì)桑枝的脫膠是很有利的。

表1 復(fù)合酶的組成及溫度對(duì)酶活的影響

酶系的耐溫特性，如表1所示，酶系中木聚糖酶、果膠酶和纖維素酶的酶活受溫度的影響較大，但在溫度40～80℃范圍都有一定的酶活。木聚糖酶在40℃到近70℃有高的酶活，果膠酶在50～70℃酶活高，纖維素酶在所選溫度范圍的穩(wěn)定性也較好。

從酶系組成、耐溫特性以及桑枝全稈化學(xué)組成方面考慮，該復(fù)合酶適合桑枝全稈制漿的改性處理。從酶系的組成和特性來(lái)看，該復(fù)合酶處理桑枝全稈所發(fā)生的物理、化學(xué)作用，主要是其中的木聚糖酶和果膠酶作用于桑枝全稈中的木聚糖和果膠。

2.2 酶處理對(duì)組織形態(tài)的影響

復(fù)合酶處理前后桑枝組織形態(tài)SEM分析如圖1所示。

圖1 酶處理前后桑枝表面及截面SEM圖

由圖1（a、b、c、d）桑皮表面SEM圖可見(jiàn)，酶處理前，桑枝表皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁完整，無(wú)明顯的空隙（圖a、c）；經(jīng)過(guò)酶處理（15 U/g）后，桑枝表皮（細(xì)胞）受到酶的侵蝕，有明顯的剝離及脫落現(xiàn)象，粗糙度增加，出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞壁被破壞，細(xì)胞的表面積增大，多孔性增加（圖b、d）。

由圖1（e、f）桑枝橫截面SEM圖可見(jiàn)，酶處理前桑枝內(nèi)部結(jié)構(gòu)較致密（圖e）；酶處理后纖維組織更加松散，出現(xiàn)“空洞”，增加了多孔性（圖f）。

上述結(jié)果是由于木聚糖酶引起半纖維素降解，部分木素和提取物溶出，少量果膠酶協(xié)同作用，破壞了桑皮胞間層結(jié)構(gòu)。多孔性增加，纖維潤(rùn)漲軟化，將有利于后續(xù)化學(xué)蒸煮時(shí)藥液滲透和反應(yīng)物溶出，提高化學(xué)品反應(yīng)性，這與后面酶處理后Soda-AQ蒸煮改性效果一致。此外，在高得率制漿過(guò)程中能降低磨漿能耗，亦可為后續(xù)的生物降解打開(kāi)孔道，提高生物煉制效率。

2.3 酶處理對(duì)化學(xué)成分的影響

2.3.1 對(duì)得率的影響

復(fù)合酶預(yù)處理的酶用量、pH值和溫度對(duì)酶解底物得率的影響如圖2所示。

圖2 不同酶處理?xiàng)l件對(duì)得率的影響

2.3.1.1 酶用量的影響

酶用量與酶水解的效果及成本關(guān)系密切。溫度50℃、pH8.0的條件下，酶用量（0～15 U/g）對(duì)纖維得率的影響如圖2a所示。由圖2a可知，隨著酶用量增加，得率呈下降趨勢(shì)。空白試驗(yàn)（酶用量為0）時(shí)，得率為94.5%，得率下降是由pH8.0、溫度50℃時(shí)的熱水提取作用所致；酶用量在0～5 U/g范圍內(nèi)，得率快速下降，下降至近90%；此后繼續(xù)增加酶用量，得率下降趨于緩和。一方面，復(fù)合酶使原料中的半纖維素、果膠和少量纖維素被降解為小分子物質(zhì)溶出，導(dǎo)致得率下降；另一方面，木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體（LCC）也可能因木聚糖酶的作用斷裂溶出，導(dǎo)致得率下降[15]。

2.3.1.2 pH的影響

pH值對(duì)酶的活性影響很大，因而對(duì)酶水解效率有重要影響。在酶用量2 U/g、溫度50℃的條件下，分析pH值對(duì)得率變化的影響。如圖2b所示，當(dāng)pH值8.0時(shí)，得率最低，表明此pH條件下酶水解效果良好；當(dāng)pH值大于或小于8.0時(shí)，得率上升，這是pH改變導(dǎo)致酶失活所致。

2.3.1.3 溫度的影響

酶的水解作用與溫度密切相關(guān)。酶用量2 U/g和pH8.0的條件下，溫度變化對(duì)得率的影響如圖2c所示，當(dāng)溫度為50℃時(shí)得率最低，酶解作用最強(qiáng)；當(dāng)溫度高于或低于50℃時(shí)，得率均升高，表明酶解作用減弱，這與溫度改變導(dǎo)致酶系失活有關(guān)。

2.3.2 對(duì)綜纖維素脫除的影響

復(fù)合酶預(yù)處理的酶用量、pH值和溫度對(duì)綜纖維素含量（相對(duì)于處理后原料）及其脫除率（相對(duì)未處理原料綜纖維素）的影響如圖3所示。

圖3 不同酶處理?xiàng)l件對(duì)綜纖維素的影響

2.3.2.1 酶用量的影響

圖3a表示溫度50℃、pH8.0條件下，酶用量與綜纖維素含量的關(guān)系。圖3a表明，隨著酶用量的增加，綜纖維素含量呈上升趨勢(shì)。由于纖維素酶含量很少，主要是木聚糖酶和果膠酶降解木聚糖和果膠，木質(zhì)素和抽出物大量溶出，導(dǎo)致綜纖維素相對(duì)含量提高。半纖維素降解量隨木聚糖酶用量增加而提高，導(dǎo)致綜纖維素脫除率增加；從綜纖維素脫除率與酶用量的關(guān)系可見(jiàn)，當(dāng)酶用量為2 U/g時(shí)綜纖維素脫除率出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，達(dá)1.3%，脫除幅度最大，此后繼續(xù)增加酶用量，脫除率上升幅度變小。

2.3.2.2 pH的影響

酶用量2 U/g、溫度50℃條件下，pH對(duì)綜纖維素及其脫除率的影響如圖3b所示。在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)，都有一定的綜纖維素（主要為木聚糖）被脫除，在pH8.0時(shí)達(dá)到最大脫除率，為1.3%。結(jié)果同時(shí)表明，該酶系具有一定的耐堿性[16]。

2.3.2.3 溫度的影響

酶用量2 U/g、pH8.0時(shí)，在40～50℃溫度范圍內(nèi)考察溫度對(duì)綜纖維素脫除的影響如圖3c所示。由圖3c可見(jiàn)，綜纖維素脫除率先上升后下降，在約50℃時(shí)脫除率達(dá)最高值1.3%。在整個(gè)溫度范圍復(fù)合酶對(duì)綜纖維素都有一定的脫除能力，說(shuō)明該酶對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣[16]。

酶用量、溫度、pH值對(duì)綜纖維素溶出的影響主要?dú)w因于復(fù)合酶含有木聚糖酶、果膠酶和少量的纖維素酶，同時(shí)與桑枝的物理結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成有關(guān)。

2.3.3 對(duì)脫木質(zhì)素的影響

此復(fù)合酶并不含漆酶，但研究中發(fā)現(xiàn)有木質(zhì)素的溶出。預(yù)處理酶用量、pH值和溫度對(duì)木質(zhì)素溶出的影響如圖4所示。

圖4 不同酶處理?xiàng)l件對(duì)木質(zhì)素的影響

2.3.3.1 酶用量的影響

在溫度50℃、pH8.0條件下，改變酶用量（0～15 U/g），觀察其對(duì)木質(zhì)素溶出的影響。如圖4a所示，在酶用量為2 U/g之前，木質(zhì)素脫除速率較大，之后繼續(xù)增加酶用量，脫除率增加緩慢，木質(zhì)素脫除率最高約為1.1%。

2.3.3.2 pH的影響

在酶用量2 U/g和溫度50℃條件下， pH值與木質(zhì)素溶出關(guān)系如圖4b所示。在pH7.0～9.0范圍內(nèi)，木質(zhì)素脫除率變化不大，在pH8.0時(shí)木質(zhì)素脫除率最高，約1%。

2.3.3.3 溫度的影響

圖4c表示酶用量2 U/g和pH8.0的條件下，溫度與木質(zhì)素脫除的關(guān)系。在40～60℃范圍內(nèi)，木質(zhì)素脫除率變化不大，在50℃時(shí)木質(zhì)素脫除率最高，約0.7%。

酶用量、pH值、溫度對(duì)木質(zhì)素溶出的影響規(guī)律有兩方面原因。一方面是由于木聚糖酶的作用，木質(zhì)素―碳水化合物復(fù)合體（LCC）中的連接鍵斷裂，使低分子量的木質(zhì)素和木聚糖溶出；另一方面，也可能與弱堿性的緩沖體系有關(guān)，它有溶出部分親水性強(qiáng)、分子量低的木質(zhì)素的作用。

綜上所述，較好的酶處理?xiàng)l件是：酶用量2.0 U/g，pH8.0，溫度50℃；酶處理能一定程度溶出桑枝中的木聚糖、果膠和木質(zhì)素等物質(zhì)，使原料結(jié)構(gòu)疏松，組織（細(xì)胞）多孔性增加，這將改善桑枝纖維組織對(duì)藥液的滲透性、反應(yīng)性。這種效應(yīng)在下面酶處理對(duì)Soda-AQ蒸煮改性中得到了體現(xiàn)。

2.4 酶處理對(duì)Soda-AQ蒸煮特性的影響

在pH8.0、50℃和2 h的條件下，以酶用量為0 U/g預(yù)處理的Soda-AQ漿為對(duì)照樣，分析不同酶用量預(yù)處理對(duì)Soda-AQ蒸煮特性的影響。結(jié)果如表2所示。

2.4.1 紙漿得率

由表2可見(jiàn)，酶用量對(duì)紙漿得率有較大的影響。經(jīng)過(guò)復(fù)合酶預(yù)處理，紙漿得率提高。對(duì)照漿（酶用量為0）得率為46.7%，卡伯值為18.7；經(jīng)酶用量2.0 U/g處理后，漿料得率提高到50.7%，且卡伯值下降為15.8，得率提高4個(gè)百分點(diǎn)、卡伯值下降2.9，體現(xiàn)了酶處理有效提高脫木質(zhì)素能力、增加了紙漿得率的效果；此后繼續(xù)增加酶用量，表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，但效果減弱。

2.4.2 脫木質(zhì)素選擇性

表2表明，卡伯值隨著酶用量增加而減少，而黏度幾乎不受影響。在酶用量?jī)H為2.0 U/g時(shí)，紙漿的卡伯值較對(duì)照漿樣的卡伯值下降2.9，而兩者的黏度相近。此后繼續(xù)增加酶用量，漿料卡伯值雖然繼續(xù)下降，但下降趨勢(shì)大大減弱。從卡伯值和黏度隨酶用量的變化關(guān)系可知，酶處理有效改善了Soda-AQ蒸煮脫木質(zhì)素的選擇性。

表2 復(fù)合酶處理對(duì)桑枝全稈Soda-AQ蒸煮特性的影響

2.4.3 堿耗

由表2可以看出，酶預(yù)處理對(duì)黑液殘堿有一定的影響。黑液殘堿量隨著酶用量增加而增加，說(shuō)明酶處理可節(jié)省用堿量。當(dāng)酶用量2 U/g時(shí)，殘堿量為7.1 g/L，較對(duì)照樣高出0.4 g/L，相當(dāng)于節(jié)省約1%用堿量。

3 結(jié)論

1）自產(chǎn)的酶是由木聚糖酶、果膠酶和少量纖維素酶組成的復(fù)合酶，有較好的耐溫耐堿性能。

2）復(fù)合酶處理能一定程度降解木聚糖、果膠和溶出木質(zhì)素，增加纖維組織的多孔性，改善了桑枝轉(zhuǎn)化利用的多相反應(yīng)條件。良好酶處理?xiàng)l件是酶用量2 U/g、pH8.0、溫度50℃。

3）酶處理明顯改善了桑枝全稈Soda-AQ蒸煮脫木質(zhì)素的選擇性，顯著提高了制漿得率，節(jié)省了蒸煮用堿量。該酶處理技術(shù)有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景。

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Influence of Alkalo-Thermophilic Xylan-Pectin Complex Enzyme Pretreatment on the Morphology, Composition and Cooking Property of Mulberry

YANG Yan, WANG Ping, YAO Qing-ling, GUO Li-fang, ZHAI Hua-min*
（Jiangsu Key Laboratory of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

To effectively utilize mulberry branch resource, self-produced complex enzymes with thermostability and alkaline tolerance, which were composed of xylanase, pectinase and a small amount of cellulose, were used to study the influence of the pretreatment on the morphology, chemical composition and cooking property of mulberry branch. The results showed that the pretreatment could degrade the hemicellulose, pectin and lignin to a certain degree and increase the porous degree of the tissue of the mulberry. The later could lay a good foundation for the mulberry transformation and utilization. The pretreatment significantly improved the delignification selectivity，the pulp yield and alkali charge in the mulberry Soda-AQ cooking process. The complex enzyme treatment has potential application prospect in the pulping and biorefinery.

xylan-pectin complex enzymes; mulberry branch; morphology; chemical composition; Soda-AQ cooking

TS743.1

A

1004-8405(2015)03-0001-08

10.16561/j.cnki.xws.2015.03.06

2015-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31070524）；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)（BE2011689）。

楊 艷（1991～），女，碩士研究生；研究方向：制漿生物煉制技術(shù)。

* 通訊作者：翟華敏（1956～），教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：制漿造紙生物煉制科學(xué)與技術(shù)研究。hzhai@njfu.edu.cn