乳腺癌原發(fā)灶間質(zhì)纖維化與免疫微環(huán)境及預(yù)后的關(guān)系

趙立朝，蔡宏劍，莊興俊，李露佳

在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境內(nèi)的成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)和免疫細(xì)胞的相互作用至關(guān)重要，也成了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［1］。腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)與正常組織相比明顯增多，其成分以膠原蛋白為主，此外還包括纖維連接蛋白、蛋白聚糖、層粘連蛋白等［2］。腫瘤基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)能夠抑制T細(xì)胞向腫瘤間質(zhì)及癌巢的浸潤(rùn)［3］，并且抑制治療藥物向腫瘤內(nèi)滲透［2］。 本研究中，筆者通過(guò)乳腺癌原發(fā)灶的HE切片觀察腫瘤間質(zhì)纖維化程度，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群（CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、CD20＋B細(xì)胞）的浸潤(rùn)強(qiáng)度。分析間質(zhì)纖維化程度與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，并分析間質(zhì)纖維化程度與早期乳腺癌術(shù)后無(wú)病生存（disease free survival，DFS）和總生存（overall survival，OS）的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn) 2001年1月—2003年12月在解放軍總醫(yī)院手術(shù)的具有完整臨床及隨訪資料以及病理標(biāo)本的Ⅰ～Ⅲ期女性乳腺癌患者。術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，病理證實(shí)為乳腺原發(fā)腫瘤，醫(yī)院病理科保存有原發(fā)腫瘤的石蠟包埋標(biāo)本，有完整的臨床資料。共136例符合標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的136例患者進(jìn)行電話隨訪，失訪10例，最終有126例患者被納入。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法 調(diào)閱126例乳腺癌患者石蠟組織標(biāo)本，連續(xù)切片3張3 μm薄片分別置于陽(yáng)離子防脫片上。石蠟切片65℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟10 min×2次，梯度乙醇水化，蒸餾水漂洗2 min×3次。將組織切片置于檸檬酸緩沖液（pH6.0）或 Tris－EDTA 緩沖液（pH9.0）中進(jìn)行高壓修復(fù)，3%H2O2中避光室溫孵育10 min，山羊血清37℃孵育10 min后滴加一抗工作液，4℃冰箱保濕盒內(nèi)過(guò)夜。所用一抗為：鼠抗人 CD8 單克隆抗體（DAKO，623，稀釋度 1∶100），兔抗人CD4單克隆抗體 （中衫金橋，ZA－0519，稀釋度1∶100），鼠抗人 CD20 單克隆抗體（DAKO，604，稀釋度 1∶200）。次日取出保濕盒，復(fù)溫30 min。漂洗后滴加適量兔鼠通用型EnVisionTM二抗工作液（DAKO），37℃孵箱孵育30 min。以上所有步驟前后均用PBS緩沖液漂洗5 min×3次。DAB顯色1～3 min，蘇木素復(fù)染胞核 1～2 min，鹽酸酒精分化，溫水返藍(lán)約5 min，顯微鏡下觀察染色及分化程度。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片保存。

實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性片為人扁桃體。陰性對(duì)照以一抗稀釋液代替一抗。

1.3 免疫組化結(jié)果及HE切片人工判讀方法 組織切片由2位獨(dú)立的病理醫(yī)師（對(duì)臨床和預(yù)后情況不知曉）分別進(jìn)行分析，核對(duì)所得結(jié)果，獲得共識(shí)。淋巴細(xì)胞癌巢浸潤(rùn)判讀：有明確的陽(yáng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)入癌巢的腫瘤細(xì)胞之間均判讀為癌巢浸潤(rùn)陽(yáng)性，否則為陰性。CD4＋、CD8＋淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤間質(zhì)密度的計(jì)數(shù)方法如下：LEICA DM2000顯微鏡下在切片腫瘤區(qū)域隨機(jī)取15個(gè)高倍視野（400×），鏡下計(jì)數(shù)間質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出平均每個(gè)高倍視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并除以高倍視野面積0.31 mm2，得出平均每平方厘米陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。CD20＋間質(zhì)細(xì)胞判讀方法：根據(jù)是否存在聚集分布將患者分為聚集陽(yáng)性和聚集陰性2組。調(diào)閱患者原發(fā)灶的HE染色切片，隨機(jī)取3個(gè)低倍視野（100×），根據(jù)細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)（HE切片中為均一的粉紅色非細(xì)胞結(jié)構(gòu)）的多少分別得出纖維化程度評(píng)分：1＋＝纖維化程度低、2＋＝纖維化程度中等、3＋＝纖維化程度高，將3個(gè)視野得出評(píng)分取平均值得到最終的纖維化程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。為連續(xù)變量的實(shí)驗(yàn)參數(shù)之間以及與連續(xù)變量的乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman秩和檢驗(yàn)。連續(xù)變量與二分類(lèi)變量臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Mann－Whitney U檢驗(yàn)，與三分類(lèi)變量臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)。分類(lèi)變量之間的相關(guān)性采用Perason Chi－Square檢驗(yàn)。年齡按照中位數(shù)（48歲）分為2組并賦值、Ki－67按照公認(rèn)臨界值14%分為2組并賦值，所得數(shù)據(jù)參與單因素和多因素的生存分析。間質(zhì)纖維化程度（中位數(shù)＝2.33）按照中位數(shù)分為2組并賦值，所得數(shù)據(jù)參與生存分析。生存分析選用Kaplan－Meier法，單因素分析顯著性檢驗(yàn)選用Log－rank檢驗(yàn)，多因素分析采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單因素P＜0.1被認(rèn)為存在相關(guān)趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者特征 對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的136例患者進(jìn)行電話隨訪，失訪10例，最終有126例患者被納入，失訪率為8.6%。截至最后隨訪期2013－07－06，中位隨訪時(shí)間104個(gè)月（7.7～138.6 個(gè)月）?；颊咧形荒挲g 48 歲（24～80 歲）。所有患者均未接受手術(shù)去勢(shì)、新輔助放化療和輔助靶向治療。32例局部復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移，27例病死；無(wú)病生存率74.6%，總生存率79.2%，中位無(wú)病生存和中位總生存期尚未達(dá)到。126例乳腺癌患者臨床病理因素描述見(jiàn)表1。

2.2 乳腺癌原發(fā)灶間質(zhì)纖維化 乳腺癌間質(zhì)觀察到不同程度的間質(zhì)纖維化（圖1）。

2.3 間質(zhì)纖維化程度與臨床病理因素的相關(guān)性分析 間質(zhì)纖維化程度與 SBR分級(jí)負(fù)相關(guān) （Kruskal－Wallis H，P＝0.024）。間質(zhì)纖維化程度與年齡、月經(jīng)狀況、臨床分期、癌栓、ER、PR、HER－2、Ki67 均不相關(guān)。

表1 126例乳腺癌患者的臨床病理特征

2.4 間質(zhì)纖維化程度與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性分析 間質(zhì)纖維化程度與CD20＋細(xì)胞聚集負(fù)相關(guān) （Mann－Whitney U，P＝0.002），與 CD4＋間質(zhì)細(xì)胞密度負(fù)相關(guān)（Spearman，P＝0.042）；與 CD4＋細(xì)胞癌巢浸潤(rùn)負(fù)相關(guān) （Mann－Whitney U，P＝0.038），與 CD20＋細(xì)胞癌巢浸潤(rùn)負(fù)相關(guān)（Mann－Whitney U，P＝0.002）。與CD8＋細(xì)胞癌巢浸潤(rùn)、CD8＋間質(zhì)細(xì)胞密度不相關(guān)。

2.5 間質(zhì)纖維化程度與預(yù)后的關(guān)系 總體分析時(shí)，單因素分析和多因素分析均未見(jiàn)間質(zhì)纖維化程度與DFS、OS的關(guān)聯(lián)性。各臨床病理因素、間質(zhì)纖維化程度與DFS、OS關(guān)系的Cox單因素分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 乳腺癌原發(fā)灶HE染色結(jié)果（200×）

表2 各影響因素與乳腺癌患者DFS、DDFS和OS關(guān)系的COX單因素分析

3 討 論

腫瘤基質(zhì)中致密的纖維結(jié)構(gòu)形成了T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)移動(dòng)的物理障礙，能夠抑制T細(xì)胞向腫瘤間質(zhì)及癌巢的浸潤(rùn)［3］。這一既往研究觀察到的現(xiàn)象在本研究中也得到了部分印證。本研究觀察到，間質(zhì)纖維化程度較低的腫瘤間質(zhì)中，CD20＋B細(xì)胞聚集的現(xiàn)象更易出現(xiàn)，CD4＋T 細(xì)胞浸潤(rùn)更多［4，5］。致密的間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)可能阻礙了B細(xì)胞之間空間上的聚集靠近。既往研究認(rèn)為，乳腺癌間質(zhì)中CD20＋B細(xì)胞聚集形成的結(jié)構(gòu)周?chē)奂鳦D4＋T細(xì)胞形成淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)，提示局部存在活躍的免疫反應(yīng)。間質(zhì)纖維化程度與CD4＋T細(xì)胞及CD20＋B細(xì)胞在癌巢中的浸潤(rùn)負(fù)相關(guān)，提示，間質(zhì)纖維化對(duì)淋巴細(xì)胞向癌巢內(nèi)移動(dòng)起到了阻礙作用。

既往研究認(rèn)為，間質(zhì)纖維化能夠促進(jìn)腫瘤侵襲并與化療耐藥有關(guān)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞大量合成I型膠原（collagen I），參與間質(zhì)重構(gòu)，形成平行有序的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲移動(dòng)［6，7］。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞合成的I型膠原與給藥后腫瘤內(nèi)較低的化療藥物濃度有關(guān)［8］。乳腺癌動(dòng)物模型研究中，用DNA疫苗降低腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞合成I型膠原后，給藥后腫瘤內(nèi)阿霉素等化療藥物的濃度顯著增加；可以將乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型的存活時(shí)間與單獨(dú)化療相比延長(zhǎng)了 3 倍［7］。

總之，乳腺癌原發(fā)灶較強(qiáng)的間質(zhì)纖維化限制了B細(xì)胞形成聚集，并且限制淋巴細(xì)胞細(xì)胞對(duì)癌巢的浸潤(rùn)，發(fā)揮了抑制免疫的作用。

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