外周全血中與老化相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)記的來源

李紅東，洪貴妮，郭政,2

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外周全血中與老化相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)記的來源

李紅東1，洪貴妮1，郭政1,2

1. 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都610054；2. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福州350108

機體老化與癌癥、神經(jīng)退行性疾病等許多復(fù)雜疾病相關(guān)。目前，研究者已在外周全血中識別了大量的與老化相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)記，這些標(biāo)記可能反映外周血白細(xì)胞在機體老化過程中發(fā)生的變化，也可能反映外周血中與年齡相關(guān)的細(xì)胞構(gòu)成比例的變化。文章利用3組正常個體外周全血DNA甲基化譜，采用Spearman秩相關(guān)分析識別了與老化相關(guān)的CpG甲基化位點(age-related DNA methylation CpG sites, arCpGs)并評價了其可重復(fù)性；利用去卷積算法估計了各外周血樣本中髓性和淋巴性細(xì)胞的比例并分析了其與年齡的相關(guān)性；比較了在外周全血、CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中識別的arCpGs的一致性。結(jié)果顯示，在獨立外周全血數(shù)據(jù)中識別的arCpGs具有顯著的可重復(fù)性(超幾何檢驗，=1.65×10-11)。外周血髓性和淋巴性細(xì)胞的比例分別與年齡顯著正、負(fù)相關(guān)(Spearman秩相關(guān)檢驗，<0.05，≤0.22)，它們間DNA甲基化水平差異較大的CpG位點傾向于在外周全血中被識別為arCpGs。在CD4+T細(xì)胞中識別的arCpGs與在外周全血中識別的arCpGs顯著交疊(超幾何檢驗，=6.14×10-12)，且99.1%的交疊位點在CD4+T細(xì)胞及外周全血中的DNA甲基化水平與年齡的正、負(fù)相關(guān)性一致。盡管在CD14+單核細(xì)胞中識別的arCpGs與在外周全血中識別的arCpGs并不顯著交疊，但是在交疊的51個arCpGs中，有90.1%的位點在CD14+單核細(xì)胞、外周全血以及CD4+T細(xì)胞中的DNA甲基化水平與年齡的正、負(fù)相關(guān)性一致，提示它們可能主要反映細(xì)胞間共同的改變。在外周全血中識別的arCpGs主要反映某些白細(xì)胞共同或特異的DNA甲基化改變，但是也有一部分反映外周血細(xì)胞比例構(gòu)成的變化。

外周全血；老化；DNA甲基化；CD4+T細(xì)胞；CD14+單核細(xì)胞

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾機制與機體老化密切相關(guān)[1,2]。在人類正常組織中，全基因組的DNA甲基化水平會隨著年齡增長呈現(xiàn)整體去甲基化的現(xiàn)象，而在某些基因(如與細(xì)胞分化相關(guān)的梳狀蛋白靶基因等)的特異CpG位點上會呈現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象[3~5]。這些與老化相關(guān)的DNA甲基化改變能夠增加基因組的不穩(wěn)定性，改變基因表達(dá)水平，從而影響各組織的正常生物學(xué)功能，提高包括癌癥在內(nèi)的許多衰老相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。在外周血中，人們已經(jīng)觀察到了與組織類似的DNA甲基化改變[6,7]。例如，通過比較百歲老人外周全血和嬰兒臍胎血中的DNA甲基化模式，發(fā)現(xiàn)老人外周全血中的DNA甲基化模式整體上呈現(xiàn)去甲基化趨勢，而與細(xì)胞分化相關(guān)的梳狀蛋白靶基因卻呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)[6]。因此，許多研究者嘗試在外周血中尋找年齡相關(guān)的DNA甲基化改變，并試圖在組織中進(jìn)行驗證，以期找到可以代替組織分子標(biāo)記的外周血分子標(biāo)記[8,9]。

研究發(fā)現(xiàn)，外周血中與天然免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的細(xì)胞會隨著年齡增大而發(fā)生功能變化[10]。例如，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的噬菌作用、自然殺傷細(xì)胞的毒性、T細(xì)胞的增生能力會隨著年齡增長而減弱[11,12]。外周血細(xì)胞的這些功能改變可能與DNA甲基化異常相關(guān)，例如T細(xì)胞隨年齡發(fā)生的功能改變可能與T細(xì)胞內(nèi)DNA整體去甲基化相關(guān)[13]。但是，目前尚不清楚在不同白細(xì)胞中隨著老化發(fā)生的DNA甲基化改變是否相同以及這些改變能否在全血中得到反映。研究者還發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞的構(gòu)成比例也會隨著年齡增大而發(fā)生變化，例如B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例會隨著年齡增大而減少[14]。由于來自髓性前體細(xì)胞和淋巴性前體細(xì)胞的白細(xì)胞(分別簡稱為髓性細(xì)胞和淋巴性細(xì)胞)之間的DNA甲基化模式存在較大差異[15,16]，這種隨年齡變化而產(chǎn)生的細(xì)胞構(gòu)成比例的變化也可能對外周全血中老化相關(guān)的DNA甲基化信號產(chǎn)生影響[15]。因此，在外周全血中識別與老化相關(guān)DNA甲基化改變時，有必要分析其來源。

本文利用3組正常個體的外周全血DNA甲基化譜，首先證明在獨立數(shù)據(jù)中識別的與老化相關(guān)的DNA甲基化CpG位點(age-related DNA methylation CpG sites, arCpGs)具有顯著的可重復(fù)性。然后，利用去卷積算法估計了各外周全血樣本中髓性和淋巴性細(xì)胞的比例，并分析了這兩類細(xì)胞的比例與年齡的相關(guān)性及其對外周全血中識別的arCpGs的影響。最后，利用淋巴性細(xì)胞亞型CD4+T細(xì)胞和髓性細(xì)胞亞型CD14+單核細(xì)胞的甲基化譜數(shù)據(jù)，分析了不同白細(xì)胞亞型的arCpGs與在外周全血中識別的arCpGs的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)

本文所分析的DNA甲基化譜數(shù)據(jù)集均來自GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫[17]。各數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息見表1。數(shù)據(jù)集Set1、Set2與Set3是同一個GEO數(shù)據(jù)系列(GEO檢索號為GSE41037)中的3組獨立數(shù)據(jù)集，分別包含193、105和96個正常的荷蘭人外周全血DNA甲基化譜[8]。這3組數(shù)據(jù)集用來尋找正常人群外周全血中的arCpGs。數(shù)據(jù)集Set4包含正常外周血中NK細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的DNA甲基化譜[18]。該數(shù)據(jù)集用作去卷積算法的參考數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集Set5和Set6分別包含來自正常個體外周血CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞的DNA甲基化譜，這兩組數(shù)據(jù)集分別用于尋找CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中的arCpGs[19]。

表1 DNA甲基化譜數(shù)據(jù)集

注：a括號外的數(shù)字是經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后保留下來用作后續(xù)分析的樣本，括號內(nèi)的數(shù)字是經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后去掉的樣本數(shù)。bSet4包含的外周白細(xì)胞亞型有NK細(xì)胞(n=12)、B細(xì)胞(n=5)、T細(xì)胞(n=16)、單核細(xì)胞(n=5)和粒細(xì)胞(n=8)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

本文所分析的DNA甲基化譜數(shù)據(jù)集均由Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip平臺檢測。該平臺共檢測了14 495個基因啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點附近的27 578個CpG位點的甲基化水平，本文只分析常染色體上的26 486個CpG位點。對于每個CpG位點，其DNA甲基化水平()由該位點的甲基化信號值()和非甲基化信號值()通過公式(1)計算[20]：

由于DNA甲基化水平檢測容易受外界因素的影響，本文采用如下的步驟來控制每組數(shù)據(jù)集的質(zhì)量。首先，在一組數(shù)據(jù)集中，如果某個樣本的DNA甲基化譜中有10%以上的位點的檢測值缺失，則去除這個樣本；對于缺失率低于10%的甲基化譜，其缺失位點的DNA甲基化水平采用k近鄰方法(k=1)補齊。然后，根據(jù)Iancu等[21]介紹的剔除異常樣本方法，對每組數(shù)據(jù)的異常樣本進(jìn)行剔除。該方法簡介如下：(1)基于每個樣本檢測的所有CpG位點的甲基化水平，計算每兩個樣本間的皮爾森相關(guān)系數(shù)；(2)計算每個樣本與其他樣本間的相關(guān)系數(shù)的均值即平均相關(guān)系數(shù)；(3)將所有樣本的平均相關(guān)系數(shù)的均值與每個樣本的平均相關(guān)系數(shù)進(jìn)行比較，如果一個樣本與其他樣本的平均相關(guān)系數(shù)處于所有樣本平均相關(guān)系數(shù)的兩倍標(biāo)準(zhǔn)差之外，則作為異常樣本剔除。對每組數(shù)據(jù)集重復(fù)上述異常樣本剔除過程3次，以確保所有的異常樣本都被去除。每組數(shù)據(jù)集中去除的樣本數(shù)目見表1。

1.3 判定與老化相關(guān)的甲基化位點(arCpGs)

本文采用Spearman秩相關(guān)的方法計算每個CpG位點的甲基化水平改變和年齡的相關(guān)性[22]，并利用BH(Benjamin and Hochberg)方法控制錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)[23]。當(dāng)一個位點的值經(jīng)FDR校正后小于0.05時，該位點被定義為老化相關(guān)的甲基化位點(arCpGs)。由于統(tǒng)計效能不足，在一組數(shù)據(jù)中通常只能夠找到部分的與老化相關(guān)的CpG位點。為了獲得一個較全的arCpGs列表，本文將在Set1、Set2和Set3中分別找到的arCpGs合并在一起，然后再按如下規(guī)則剔除不可靠的arCpGs：(1)如果在一組數(shù)據(jù)集中識別的一個arCpG位點在其他兩組數(shù)據(jù)集中的Spearman秩相關(guān)值都大于0.05，則剔除該位點；(2)如果一個位點在不同數(shù)據(jù)集中與年齡的正負(fù)相關(guān)性不同，亦剔除該位點。

在采用BH等方法控制多次檢驗的總體錯誤發(fā)現(xiàn)率時，通常會導(dǎo)致檢驗效能降低而難以在小樣本數(shù)據(jù)中識別出顯著差異的結(jié)果[24]。另一方面，僅以未經(jīng)過校正的Spearman秩相關(guān)的值<0.05判斷位點與年齡相關(guān)的顯著性，又可能會出現(xiàn)過高的假陽性率。由于Set5和Set6分別只包含21和20個樣本，本文利用“delete-1-jackknife[25]”方法識別這兩組數(shù)據(jù)集中的arCpGs。采用“delete-1-jackknife”方法篩選在樣本構(gòu)成小幅度改變的條件下顯著性水平(Spearman秩相關(guān)值<0.05)相對穩(wěn)定的arCpGs，雖然無法校正多次檢驗的總體FDR，但是可減少由于某個樣本的異常而導(dǎo)致的假陽性位點。該方法簡介如下：每次從數(shù)據(jù)集中去掉一個樣本，在剩下的樣本中利用Spearman秩相關(guān)的方法按<0.05顯著性水平尋找arCpGs；當(dāng)數(shù)據(jù)集中的每個樣本都被去除過一遍之后，即重復(fù)了(為該數(shù)據(jù)集的總樣本數(shù))次實驗后，如果一個位點在所有次實驗中都被判定為arCpGs，則該位點定義為該數(shù)據(jù)集的arCpGs。

1.4 在不同數(shù)據(jù)集中識別的arCpGs的重復(fù)性和一致性

假設(shè)識別自不同數(shù)據(jù)集的兩個arCpGs列表分別包含L和L個CpG位點，且交疊了個位點，那么在這兩個列表中觀察到至少個位點交疊的隨機概率可以用累計超幾何分布來估計，計算公式如下：

其中代表背景位點數(shù)目。當(dāng)<0.05時，則判定這兩個arCpGs列表具有非隨機的重疊。

如果一個交疊位點的DNA甲基化水平在這兩組數(shù)據(jù)集中與年齡的正負(fù)相關(guān)性相同，則定義該位點為在兩組數(shù)據(jù)集中與老化相關(guān)的一致位點。假設(shè)兩個arCpGs列表交疊的個位點中有個一致位點，那么這兩個列表交疊位點的一致性為。一致性的隨機概率利用公式(3)計算。

其中0表示一個CpG位點在兩組數(shù)據(jù)集中正、負(fù)相關(guān)性相同的隨機概率，即0.5。

1.5 估計外周血中髓性細(xì)胞和淋巴性細(xì)胞的比例

利用Houseman等[26]開發(fā)的去卷積算法，估計各個外周全血樣本中髓性細(xì)胞和淋巴性細(xì)胞的比例。Houseman等通過單因素方差分析在Set4中篩選出在各白細(xì)胞亞型間DNA甲基化水平方差變異程度最大的500個位點，并證實采用這500個特征位點，通過去卷積算法對DNA甲基化譜進(jìn)行分解可獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，本文利用這500個位點作為外周白細(xì)胞亞型的特征位點進(jìn)行去卷積分析。該算法簡單用公式(4)表示：

其中，代表特征位點在外周白細(xì)胞亞型中的DNA甲基化水平矩陣，表示每個外周血樣本中各種白細(xì)胞亞型的比例，代表外周全血中的DNA甲基化譜數(shù)據(jù)矩陣。去卷積的目標(biāo)是求得上述方程的解，即求得從而得到外周血各類型白細(xì)胞在每個樣本中的比例[26]。然后，將來自髓性與淋巴性前體細(xì)胞的各種白細(xì)胞的比例分別相加，作為髓性與淋巴性細(xì)胞的比例。

1.6 判定髓性和淋巴性細(xì)胞間的差異甲基化位點

本文將Set4中的各類細(xì)胞按照髓性和淋巴性前體來源分為兩組，再利用秩和檢驗判斷位點在這兩組細(xì)胞間的DNA甲基化水平發(fā)生差別的概率，并采用BH(Benjamin and hochberg)方法控制FDR。當(dāng)一個位點的值經(jīng)FDR校正后小于0.05時，判定該位點在兩組細(xì)胞間顯著差異。

1.7 老化相關(guān)甲基化位點的功能富集分析

利用Gene Ontology (GO)[27]的生物學(xué)過程(Bio-log--ical process)功能注釋體系對老化相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析。首先，利用GEO提供的DNA甲基化芯片平臺Illumina Infinium Human Methylation27 BeadChip的注釋文件GPL8490-65.txt，將DNA甲基化位點注釋到基因上。本文所分析的26 486個CpG位點共注釋到13 890個基因(稱為背景基因)，并將其中與老化相關(guān)的位點注釋到的基因稱為老化相關(guān)的基因。

如果在個背景基因中，有L個基因與老化相關(guān)，其中個被注釋到包含L個基因的GO功能結(jié)點中，那么隨機情況下在這個GO功能結(jié)點中至少觀察到個與老化相關(guān)的基因的概率可以通過累積超幾何分布模型計算(公式2)。判定GO功能結(jié)點顯著的標(biāo)準(zhǔn)是該節(jié)點的值經(jīng)FDR校正后小于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周全血中與老化相關(guān)的DNA甲基化改變的可重復(fù)性

利用Spearman秩相關(guān)分析，控制FDR<0.05，本文從數(shù)據(jù)集Set1、Set2和Set3中分別找到1239、1481、128個arCpGs，再將這3個arCpGs列表進(jìn)行兩兩配對比較，結(jié)果如表2所示。任意兩個列表的arCpGs都顯著交疊(超幾何檢驗，<1.65×10-11)，且交疊部分的CpG位點的DNA甲基化水平與年齡的正、負(fù)相關(guān)性在兩個列表中完全一致(二項分布檢驗，<2.2×10-16)，提示在不同數(shù)據(jù)集中找到的與年齡相關(guān)的DNA甲基化位點存在顯著的可重復(fù)性[28]。因此，本文利用1.3中介紹的方法，將3組數(shù)據(jù)集各自找到的arCpGs整合在一起，形成了一個包含1461個CpG位點的外周全血arCpGs列表，其中860個CpG位點與年齡正相關(guān)，601個CpG位點與年齡負(fù)相關(guān)。

表2 在不同數(shù)據(jù)集中識別的arCpGs比較

2.2 外周血細(xì)胞構(gòu)成比例變化對外周全血中的arCpGs的影響

利用去卷積算法估計數(shù)據(jù)集Set1-3中的各個外周血樣本中髓性和淋巴性細(xì)胞比例后，本文采用Spearman秩相關(guān)檢驗分析了髓性和淋巴性細(xì)胞的比例與年齡的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在這3組數(shù)據(jù)集中，髓性細(xì)胞與淋巴性細(xì)胞的比例變化與年齡分別呈現(xiàn)顯著的正、負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman秩相關(guān)檢驗，<0.05，表3)，即外周全血中髓性與淋巴性細(xì)胞的比例分別隨著年齡增大而增加、減少。在此前提下，若一個CpG位點在髓性細(xì)胞中的甲基化水平顯著高于或低于在淋巴性細(xì)胞中的甲基化水平，即使該CpG位點在各類細(xì)胞中的DNA甲基化水平與年齡不相關(guān)，也可在外周全血中觀察到該位點的甲基化水平與年齡顯著地正相關(guān)或負(fù)相關(guān)[16]。在控制FDR<0.05的水平下，本文首先從Set4中識別了7184個DNA甲基化水平在髓性和淋巴性細(xì)胞間顯著差異的CpG位點，記為mlCpGs。將外周全血中的arCpGs和mlCpGs比較，發(fā)現(xiàn)在外周全血中識別的1461個arCpGs中有1043(71.4%)個arCpGs與mlCpGs重疊，其中有798個位點(76.5%)的DNA甲基化水平在外周全血中與年齡的正、負(fù)相關(guān)性和其在髓性細(xì)胞中相對于淋巴性細(xì)胞的差異高、低甲基化不對應(yīng)。該結(jié)果提示，大部分在外周全血中觀察到的arCpGs并非由髓性與淋巴性細(xì)胞構(gòu)成比例變化決定，而是反映白細(xì)胞內(nèi)部的DNA甲基化改變。

另一方面，如圖1所示，當(dāng)CpG位點的DNA甲基化水平在髓性和淋巴性細(xì)胞間的差異程度大于0.3與0.35時，mlCpGs和外周全血中的arCpGs分別交疊了44與27個位點，它們與年齡的正、負(fù)相關(guān)性和其在髓性相對于淋巴性細(xì)胞間的差異甲基化方向的一致性分別提高到81.8%與92.6%，具有顯著的非隨機性(二項分布檢驗顯著水平分別為<1.27×10–5，<2.82×10–6)。該結(jié)果提示，在外周全血中觀察到的部分arCpGs主要受髓性和淋巴性細(xì)胞比例變化的影響，反映這兩類細(xì)胞間的差異DNA甲基化信號。

2.3 外周全血中的arCpGs與CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中的arCpGs比較

外周全血中大部分的arCpGs可能反映白細(xì)胞亞型內(nèi)部的DNA甲基化改變。因此，本文進(jìn)一步分析外周全血中的arCpGs與在白細(xì)胞亞型中識別的arCpGs的關(guān)系。受數(shù)據(jù)限制，只能以淋巴性前體細(xì)胞來源的CD4+T細(xì)胞和髓性前體細(xì)胞來源的CD14+單核細(xì)胞為例進(jìn)行初步分析。由于這兩組數(shù)據(jù)集檢測的樣本數(shù)量過少，在FDR<0.05時，本文在檢測CD4+T細(xì)胞的數(shù)據(jù)集Set5和檢測CD14+單核細(xì)胞的數(shù)據(jù)集Set6中未找到arCpGs。因此，利用類似“delete-1-jackknife”的方法[25]，分別在Set5和Set6數(shù)據(jù)集中找到了901個CD4+T細(xì)胞arCpGs和831個CD14+單核細(xì)胞arCpGs，這兩個arCpGs列表只隨機交疊了24個位點(超幾何檢驗，=0.822)，其中有21.7%的位點與年齡的正、負(fù)相關(guān)性在這兩種細(xì)胞中不一致，提示這兩種細(xì)胞的arCpGs可能不同。

表3 外周血中髓性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比例與年齡的相關(guān)性

注：*代表Spearman相關(guān)性的顯著性水平<0.05。

圖1 細(xì)胞比例構(gòu)成變化對外周全血中的arCpGs的影響

圖中橫坐標(biāo)表示CpG位點的DNA甲基化水平在髓性和淋巴性細(xì)胞間的平均差值；左縱坐標(biāo)表示在橫坐標(biāo)對應(yīng)的平均差值下，識別的與年齡相關(guān)的CpG位點個數(shù)；右縱坐標(biāo)表示在橫坐標(biāo)對應(yīng)的平均差值下，外周全血arCpGs與年齡正、負(fù)相關(guān)性與其在髓性和淋巴性細(xì)胞間差異方向一致的比例。

分別將CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞的arCpGs與外周全血arCpGs比較。結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞arCpGs與外周全血arCpGs非隨機交疊了217個位點(超幾何檢驗，=6.14×10-12)，其中有99.1%的位點的DNA甲基化水平在CD4+T細(xì)胞和外周全血中與年齡的正、負(fù)相關(guān)性相同，呈現(xiàn)非隨機高的一致性(二項分布檢驗，<2.2×10-16)，說明CD4+T細(xì)胞中的一部分arCpGs能夠在外周全血中反映。然而，CD14+單核細(xì)胞arCpGs只與外周全血arCpGs隨機交疊了51個位點(超幾何檢驗，=0.232)，其中有48個位點的DNA甲基化水平與年齡正、負(fù)相關(guān)性在CD14+單核細(xì)胞和外周全血中一致(二項分布檢驗，=9.83×10-12)。值得注意的是，在這48個位點中，有46個位點在CD14+單核細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞中與年齡的正、負(fù)相關(guān)性一致，提示這些位點可能是細(xì)胞間共同的與年齡相關(guān)的甲基化改變[19]。

在FDR<0.05的條件下，分別對在這兩種細(xì)胞中識別的arCpGs進(jìn)行GO功能富集。結(jié)果顯示，CD4+T細(xì)胞arCpGs注釋到的670個基因顯著富集于20個GO功能結(jié)點，主要涉及發(fā)育過程、多細(xì)胞過程和細(xì)胞分化等相關(guān)的功能類(表4)。本文還發(fā)現(xiàn)，這20個GO功能結(jié)點也都顯著富集了外周全血中的arCpGs (FDR<0.05)，提示在外周全血中能夠發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞中的arCpGs涉及的大部分功能。另一方面，在FDR<0.05的條件下，CD14+單核細(xì)胞arCpGs注釋到的610個基因沒有富集到任何GO功能結(jié)點，提示在CD14+單核細(xì)胞中識別的arCpGs缺乏功能集聚特征。以上結(jié)果進(jìn)一步提示這兩種細(xì)胞的arCpGs可能存在差異。

表4 CD4+T細(xì)胞中arCpGs所注釋基因富集到的GO功能結(jié)點

3 討 論

本文結(jié)果顯示在外周全血中存在著穩(wěn)定的與老化相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)記。外周全血中髓性細(xì)胞和淋巴性細(xì)胞的比例分別與年齡顯著地正、負(fù)相關(guān)，這可能反映了隨著年齡的增長，造血干細(xì)胞更趨向于分化為髓性細(xì)胞[7]。但是，由于細(xì)胞比例與年齡的相關(guān)系數(shù)的絕對值較小，僅為0.16~0.22(表3)，在兩類細(xì)胞間DNA甲基化水平差異程度較小的arCpGs主要反映白細(xì)胞內(nèi)部的DNA甲基化改變。但是，仍然有一部分在髓性細(xì)胞和淋巴性細(xì)胞間DNA甲基化水平差異較大的位點傾向于在外周全血中被識別為arCpGs(即這部分arCpGs由細(xì)胞構(gòu)成比例改變決定)。雖然Xu等[9]也分析過外周血白細(xì)胞比例變化對外周全血中的arCpGs的影響，但是由于他們僅評估了50個位點，未能發(fā)現(xiàn)本文的一個重要的結(jié)論，即在這兩類細(xì)胞間DNA甲基化水平差異較大的位點傾向于在外周全血中被識別為arCpGs。由于目前尚缺乏伴有年齡信息的外周血各種白細(xì)胞亞型的DNA甲基化數(shù)據(jù)，本文只分析了CD4+T細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中的arCpGs。值得注意的是，雖然CD4+T細(xì)胞只占外周白細(xì)胞總量的13%左右，但是許多CD4+T細(xì)胞的arCpGs卻能在外周全血中被觀察到。由于淋巴性細(xì)胞亞型間DNA甲基化模式相似，而淋巴性和髓性細(xì)胞間甲基化模式差異較大[15,16]，對此現(xiàn)象的一種解釋是其他淋巴性細(xì)胞上可能發(fā)生了與CD4+T細(xì)胞相似的改變。和CD4+T細(xì)胞不同，CD14+單核細(xì)胞的arCpGs與外周全血中的arCpGs沒有顯著交疊。但是，在這些交疊的arCpGs中，有90.1%的位點在CD14+單核細(xì)胞和全血中與老化的相關(guān)性一致，并且在CD4+T細(xì)胞中與老化的相關(guān)性也一致，提示這些位點可能反映了細(xì)胞間共同的與年齡相關(guān)的變化。Rakyan等[19]僅分析了CD4+T細(xì)胞與CD14+單核細(xì)胞共同識別的部分arCpGs，也發(fā)現(xiàn)了兩者交疊且一致的arCpGs在外周全血中表現(xiàn)為與老化相關(guān)。本文對這兩種細(xì)胞的arCpGs的比較分析進(jìn)一步提示了這兩種細(xì)胞可能存在各自特異的arCpGs，同時本文也評估了它們對在外周全血中觀察到的arCpGs的影響。對在CD14+單核細(xì)胞中識別的大部分arCpGs未能在全血中反映的現(xiàn)象存在多種可能的解釋：(1)檢測該細(xì)胞的樣本太少，導(dǎo)致識別其arCpGs的統(tǒng)計效能不足或假陽性結(jié)果過多；(2)該細(xì)胞在外周血白細(xì)胞中所占比例較小(6%左右)，其大部分arCpGs未在其他(髓性)細(xì)胞出現(xiàn)，因此這些arCpGs信號可能被其他細(xì)胞上的arCpGs信號所掩蓋；(3)由于相對于淋巴性細(xì)胞，髓性細(xì)胞在外周血中的存活時間很短[29]，因此髓性前體細(xì)胞分化時出現(xiàn)髓性細(xì)胞特異的年齡相關(guān)的DNA甲基化改變的機會較小。然而，這些推測還需要更多的實驗數(shù)據(jù)來進(jìn)一步驗證。

老化相關(guān)的分子改變與癌癥等老化相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)[1]。本文的分析結(jié)果顯示，外周全血中與老化相關(guān)的DNA甲基化改變主要反映白細(xì)胞內(nèi)部及細(xì)胞比例構(gòu)成的改變。但是，癌癥外周血中的異常DNA甲基化信號主要由疾病狀態(tài)下外周全血中髓性和淋巴性細(xì)胞的比例變化決定[16]。因此，在分析外周全血中的arCpGs和疾病的關(guān)系時，應(yīng)該首先排除外周血細(xì)胞構(gòu)成比例變化對疾病相關(guān)標(biāo)記的影響。

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(責(zé)任編委: 方向東)

Age-related DNA methylation changes in peripheral whole blood

Hongdong Li1, Guini Hong1, Zheng Guo1,2

Aging is associated with many complex diseases such as cancer and neurodegenerative diseases. Recently, many age-related DNA methylation biomarkers in peripheral whole blood have been identified. These biomarkers may reflect DNA methylation changes derived from changes in the number of a specific leukocyte cell type during aging. To clarify the source of these age-related DNA methylation changes, we analysed DNA methylation profile of peripheral whole blood from three independent cohorts of healthy subjects and identified age-related DNA methylation CpG sites (arCpGs) using the Spearman’s rank test with high reproducibility (Hypergeometric test,=1.65×10-11). Using a deconvolution algorithm, we found that the proportion of myeloid lineage cells was increased while that of lymphoid lineage cells was decreased in the peripheral whole blood with age (Spearman’s rank correlation test,<0.05,≤0.22). The CpG sites, whose methylation levels were significantly different in myeloid cells and lymphoid cells, were preferentially recognized as arCpGs in peripheral whole blood.Moreover, the arCpGs in CD4+ T cells significantly overlapped with that in peripheral whole blood (Hypergeometric test,=6.14×10-12) and 99.1% of the overlapping arCpGs had consistent positive or negative correlations with age. Though the arCpGs in CD14+ monocytes did not significantly overlap with that in peripheral whole blood (Hypergeometric test,=0.232), 90.1% of 51 overlapping arCpGs were correlated with age in CD14+ monocytes, peripheral whole blood, and CD4+ T cells consistently. In summary, most of the methylation changes in arCpGs identified in peripheral whole blood come from common or specific DNA methylation changes in leukocyte subtypes, while part of them reflect alterations in the number of specific cell types of leukocytes.

peripheral whole blood; aging; DNA methylation; CD4+ T cells; CD14+ monocytes

2014-11-12;

2014-11-20

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81372213，81201822)資助

李紅東，博士研究生，研究方向：生物信息學(xué)。Tel: 028-83207187；E-mail: biomantis_lhd@163.com

郭政，博士，教授，研究方向：生物信息學(xué)。E-mail: guoz@ems.hrbmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-394

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2014-10-15 8:06:17

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141015.0806.002.html